[发明专利]一种末端脱氧核苷酸转移酶的突变体及其应用

说明书

本发明公开一种末端脱氧核苷酸转移酶的突变体，其特征在于：包含如SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列或功能等同序列，以及至少在对应于残基P215的位置处的一个氨基酸取代或功能等同残基，其中该位置参照SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列编号；所述突变体能够在没有模板的情况下合成核酸片段；所述突变体能够将修饰的核苷酸掺入到核酸片段中。

技术领域

本发明涉及一种末端脱氧核苷酸转移酶的突变体及其应用，属于基因工程、酶工程领域，具体涉及一种末端脱氧核苷酸转移酶、其编码基因及其表达和应用。

背景技术

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是遗传工程中的重要工具酶之一，是一种特殊的DNA聚合酶，可以在没有模板存在的条件下催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。此外，带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。

末端转移酶在分子生物学中应用广泛，例如，该酶可用于cDNA末端的快速扩增(RACE)中添加核苷酸，并可以用来作为在后续PCR的引物的模板；在检测细胞凋亡常用的TUNEL检测中，该酶也可以用于添加标记放射性同位素的核苷酸；在基因测序中，可使用该酶在3’末端加双脱氧核苷酸封端，以此降低测序反应的杂信号的产生。

小牛胸腺TdT是一种常用的类型，目前野生型末端转移酶以非天然脱氧核糖核苷酸如ddNTP为底物时封端效率较低，反应时间过长，且在37℃持续工作时衰减较快。通过对蛋白结构分析，突变部分位点，提高TdT末端转移酶的活性以及持续工作能力显得尤为重要，因此需要开发一种高活性和高稳定性的末端脱氧核苷酸转移酶。

发明内容

本发明提供一种小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶的突变体，通过突变关键位点的氨基酸改变氨基酸的带电性或疏水性，从而改变酶的空间结构，使其可以更好地与DNA结合，从而提高末端转移酶3’OH末端的催化能力，该突变体具有更高的酶活性，且在37℃保存下该突变体的稳定性更高。

具体的，本发明提供一种末端脱氧核苷酸转移酶的突变体，其特征在于：

包含如SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列或功能等同序列，以及至少在对应于残基P215的位置处的一个氨基酸取代或功能等同残基，其中该位置参照SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列编号；

所述突变体能够在没有模板的情况下合成核酸片段；

所述突变体能够将修饰的核苷酸掺入到核酸片段中。

根据优选的实施方式，所述修饰的核苷酸包括3’O-修饰的核苷酸，更优选地，包括3’O-封闭的核苷酸。

根据优选的实施方式，所述取代选自P215D、P215E、P215V。

根据优选的实施方式，所述突变体还在对应于选自F267和G372的残基的位置处包含至少一个氨基酸取代或功能等同残基。

根据优选的实施方式，所述突变体在对应于选自P215、F267和G372的残基的位置处包含至少两个氨基酸取代，优选地包含三个氨基酸取代。

根据优选的实施方式，所述取代选自P215D/E/V、F267A/G/S、G372I/Q/T。

根据优选的实施方式，所述突变体在SEQ ID NO:2或功能等同序列的N末端和/或C末端处包含标签序列，包括组氨酸标签序列。

本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码如前面所述任一项中定义的末端脱氧核苷酸转移酶的突变体。

本发明还提供一种表达载体，所述表达载体中包含前述的核酸分子序列。

本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述的核酸分子或前述的表达载体。