[发明专利]一种基于M基因核苷酸片段删除的流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用

说明书

本发明涉及一种流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用，属于减毒疫苗技术领域。本发明所述致弱方法，包括以下步骤：删除流感病毒M2部分基因序列，利用反向遗传操作系统，拯救出致弱流感病毒株。本发明致弱方法所产生的致弱病毒株具有良好生长特性和生产安全性，可以在鸡胚中快速生长繁殖，给生产致弱病毒疫苗候选株带来巨大便捷；同时，致弱毒株具有限制性复制能力，并非单次感染细胞，能够产生高水平病毒HAI效价，免疫小鼠攻毒后状态良好，10天内体重恢复健康水平，为开发流感减毒疫苗奠定基础。

技术领域

本发明涉及减毒疫苗技术领域，具体涉及一种流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用。

背景技术

流感病毒属于正黏病毒科单股负链分节段RNA病毒，根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M1)抗原性的区别可以分为A，B，C，D型。A型流感病毒(IAV)普遍感染人和禽类动物等多种宿主。B型流感病毒(IBV)宿主特异性强，目前发现主要感染人和海豹。C型流感病毒致病症状轻微，主要感染人和猪。大多数有症状的流感病例都是由A型和B型流感病毒引起。IAV和IBV基因组都包含8个节段，分别为PB1，PB2，PA，HA，NP，NA，M，NS，不同的亚型可以编码10个或者11个蛋白，其中囊膜蛋白HA负责识别和结合细胞表面唾液酸受体，帮助病毒入侵细胞，囊膜蛋白NA负责移除HA和唾液酸受体之间的结合，帮助子代病毒释放。除不同基因组片段内核苷酸的突变，作为一种基因组分段的病毒，流感病毒不同菌株和谱系之间的基因片段可以在伴随感染期间经历重配，形成新的病毒亚型。

由于流感病毒高度的遗传漂变，几乎每年都会暴发，导致需要每年度根据当季流行的毒株进行疫苗生产研发。这就需要快速成熟的疫苗生产体系，灭活疫苗和减毒活疫苗可以满足以上要求。灭活疫苗一般是通过病毒反向遗传操作技术获得重配株或者自然筛选流行株，在体外大量培养，将病毒灭活、纯化后制备而成。流感重配疫苗候选株将当季流行的流感病毒毒株的HA和NA基因与WHO推荐的高生长特性的毒株的6个内部基因，如A/PuertoRico/8/1934 H1N1(PR8)，通过病毒反向遗传技术而获得的。相比灭活疫苗，减毒活疫苗是对病毒的基因组进行修改，获得病毒致弱的特性，比较常见的是冷适应温度敏感型减毒活疫苗，可以通过鼻腔黏膜途径免疫。但研究显示，冷适应株疫苗保护效率在儿童中严重不足，具体为2013～2014年(18％)，2014～2015年(28％)，和2015～2016年(48％)，可见，冷适应株的免疫效果并不理想。

另一种减毒活疫苗是对病毒基因组进行修改后，再利用病毒反向遗传学技术生产限制性感染的致弱病毒毒株。目前，已经有研究报道对NS节段，M节段的基因进行突变而产生缺陷型致弱毒株。但目前还缺乏高效而稳定的流感病毒致弱方式。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用。本发明致弱方法所产生的致弱病毒株具有良好生产安全性，不仅毒力减弱，同时拥有较好的生长特性，可以在鸡胚中快速生长繁殖，给生产带来巨大便捷；另外，本发明所产生的致弱病毒株具有限制性复制能力，可以产生高水平病毒HAI效价，免疫小鼠攻毒后状态良好，10天内体重恢复健康水平，为开发流感减毒疫苗奠定基础。

本发明提供了一种流感病毒的致弱方法，包括以下步骤：

删除流感病毒M2部分基因序列，利用反向遗传操作系统，拯救出致弱流感病毒株。

优选的是，所述致弱方法的背景毒株包括A/Puerto Rico/8/1934。

优选的是，所述删除包括删除流感病毒M基因第767位碱基到第877位碱基之间任意位置和长度的核苷酸序列。

优选的是，所述删除包括删除M2以下基因序列之一：SEQ ID NO.1～6。

优选的是，删除流感病毒M2部分基因序列后的流感病毒M基因的核苷酸序列如SEQID NO.7～12之一所示。