[发明专利]胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法

说明书

本发明公开了一株分泌表达胶原蛋白肽‑牛乳铁蛋白肽融合蛋白的重组巴斯德毕赤酵母菌株，编码该所述的胶原蛋白肽‑牛乳铁蛋白肽融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEC ID NO.6所示。通过构建融合基因表达其融合蛋白，其氨基酸序列包括胶原蛋白肽序列，牛乳铁蛋白肽序列。由于牛乳铁蛋白肽表达量低，通过此融合表达证明产量较高的胶原蛋白肽能作为携带标签更好的引导牛乳铁蛋白肽的表达，从而增加表达量，为之后研究及生产提供更好的方向。

(一)技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的是一种胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法。

(二)背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是1960年Groves首先从牛乳分离出来的，由于乳铁蛋白与铁结合形成红色的复合物，故始称为“红蛋白”。乳铁蛋白是一种糖蛋白，存在于哺乳动物多个腺体中，如乳汁、泪液、唾液和其他外分泌液或中性粒细胞、血浆中，研究表明在初乳中含量最高。

牛乳铁蛋白由于抗菌活性和抑制非正常细胞的生长的能力而具有调节机体免疫力能力的作用，并被广泛应用于饲料和食品添加剂、化妆品以及医药等行业。牛乳铁蛋白具有较高等电点，蛋白表面带正电，是一种碱性蛋白，其具有抗菌，抗病毒，参与铁代谢，参与免疫调节，抗氧化和抑制肿瘤细胞等多种生物学功能，已经作为一种抗菌肽和营养物质并具有重要的研究价值。牛乳铁蛋白的稳定性与pH、温度、盐类及缓冲液环境等多种因素相关。已对牛乳铁蛋白在不同温度下的热稳定性进行了研究，结果表明，超高温瞬时法在一定程度上会破坏牛乳铁蛋白的活性，而巴氏消毒法则不会破坏其活性。

牛乳铁蛋白经消化道分解变成25个氨基酸残基按顺序构成的较小的多肽，这些多肽是牛乳铁蛋白中第17～41位氨基酸残基，这些活性小肽和细胞功能关系密切，可以增强正常细胞的水平，破坏非正常细胞，这些特性使牛乳铁蛋白具有抑菌、杀灭细菌以及防止微生物感染细胞的作用。

就目前研究报道中，Montoya等利用大肠杆菌表达系统表达重组牛乳铁蛋白，其产量为15.3mg/L，并且验证了牛乳铁蛋白的抗菌活性。Rosano等研究表明，原核表达系统表达的蛋白对细胞本身产生毒性而影响细胞的正常生长。2002年，Wang等利用毕赤酵母表达猪乳铁蛋白，表达量为12mg/L；Paramasivam等利用毕赤酵母表达马乳铁蛋白，表达量达到了40mg/L。2006年，Dong等利用毕赤酵母表达耗牛乳铁蛋白，表达量为40mg/L。2007年，Chen等利用毕赤酵母表达羊乳铁蛋白，表达量为2mg/L。2019年，Sun等采用融合表达的方法将牛乳铁蛋白N端与其他抗菌肽融合，表达量为35.6mg/L。Isui和Jose等人成功克隆了牛乳铁蛋白肽(LfcinB)的cDNA基因，与硫氧还蛋白组成融合蛋白，构建pET32-bLf重组表达载体，转入大肠杆菌进行表达，经过镍柱分离纯化后，产量为15.3mg/L；Zigang Tian等人设计合成LfcinB衍生肽多聚体序列，插入表达载体pET32a，IPTG诱导表达，表达量最高达到10mg/L；易俊波等人将LfcinB基因片段克隆到分泌型表达载体pPIC9K中，得到重组质粒，线性化电转毕赤酵母，经甲醇诱导后，LfcinB在酵母中获得了表达，但需要浓缩10倍才能在SDS-PAGE胶上看见明显条带，说明其表达量很低。综合文献结果分析表明，牛乳铁蛋白及牛乳铁蛋白肽在分泌表达中产量都相对较低，无法达到生产需求，目前并无表达量高的规模化生产牛乳铁蛋白肽的报道。