[发明专利]一种牛无绿藻PCR引物及其应用

说明书

本发明公开了一种根据牛无绿藻cob基因设计的PCR检测引物，其核苷酸序列如下：cob‑5‑F：CTAGTTATTCAAGTCCTCG；cob‑5‑R：AATTACTGTAGCACCCC，所述牛无绿藻cob基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明还公开了所述的PCR检测引物在牛无绿藻非诊断目的检测中的应用。本发明通过对牛无绿藻cob基因的PCR引物进行筛选，得到一对灵敏度高且特异性强的引物，将该引物结合荧光定量PCR技术，能够直接对牛奶样品中的牛无绿藻进行定性以及定量测定，在早期快速诊断牛无绿藻性乳腺炎方面具有明显的优势。

技术领域

本发明属于分子检测领域，涉及到一种牛无绿藻(Prototheca bovis)的PCR引物，本发明还涉及所述PCR引物在牛无绿藻非诊断目的检测中的应用以及一种牛无绿藻实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

牛无绿藻(Prototheca bovis)是一种类酵母样的真核生物，曾被称为中型无绿藻2型(Prototheca zopfii genotype 2)，能导致奶牛发生乳房炎，使患牛产奶量下降、奶品质降低。1952年，Lerche报道了第一例牛无绿藻性乳腺炎(Lerche,et al.,1952)。随后，由牛无绿藻引起的奶牛乳腺炎在德国、日本、意大利、波兰、加拿大、韩国等多个国家相继报道。在波兰的16个奶牛场的400头奶牛及其周围环境的1211份样本中发现，牛无绿藻是最常见的乳腺炎病原体，且75.8％病例具有亚临床病程(Lloyd D,et al.,1968)。2011年，中国首次报道了牛无绿藻引起的临床型乳房炎暴发，分离率高达72.7％(张寒琪等，2011)。Shahid等报道了由北京、天津和山东等地采集的620份牛奶样品和410份环境样品中，分别分离出84份和21份牛无绿藻，分离率分别为13.5％和5.1％(Shahid M,et al.,2016)。本课题组进一步在某牛无绿藻阳性奶牛场调查发现，在体细胞数高于100万个/mL的40份乳样中，牛无绿藻阳性率高达65％(许顺鑫，2021)。

牛无绿藻乳腺炎的临床诊断极易被误判为真菌或漏诊，在已报道的病例中，牛无绿藻通常是在分娩后立即感染奶牛，在哺乳开始时发现，初期临床症状通常不明显，呈亚临床或慢性经过(Dubravka M,et al,2006；Shahid M,et al.,2017)，导致奶牛产奶量下降，奶品质降低，奶牛分泌含有白色薄片的稀水牛奶，甚至导致牛乳腺坏死及奶牛过早淘汰，感染奶牛成为持续的传染源而使该病在养殖场内不断蔓延。因临床症状缺乏特异性，该病很容易被忽略或被认为是其他原因造成的乳腺炎，因而耽误治疗和处理，严重威胁着奶牛健康、生鲜乳质量安全和奶业的持续健康发展。

现阶段关于牛无绿藻的快速诊断研究较少，病原的分离鉴定是目前最经典的诊断方法，但病原的鉴别培养时间一般超过48小时，通常作为其他方法的比较和参考。常规PCR技术一般用于纯培养物的定性检测，无法直接检测牛奶样品，而且涉及步骤较多，存在一定交叉污染风险，制约了该项技术的实际应用。

例如CN110184379A公开了一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用，针对中型无绿藻基因1型和2型的cob基因分别设计引物，利用设计的引物及获取的DNA模板进行PCR反应，结果表明，针对中型无绿藻基因2型cob基因设计的引物，能够从中型无绿藻基因2型中扩增出目的片段，而无法从中型无绿藻基因1型中扩增出目的片段，该结果表明所设计的cob引物能正确区分中型无绿藻的两种基因型。但由于该引物的检测灵敏度低，无法对奶样直接进行检测，需要对牛奶样品进行病原的分离培养，得到扩增的菌液后才能进行检测，更无法进行定量检测。

本发明通过对牛无绿藻cob基因的PCR引物进行大量筛选，得到一对灵敏度高且特异性强的引物，该引物能够直接从离心处理的牛奶样品中检测出牛无绿藻，而无需进行扩大培养等步骤。该引物结合实时荧光定量PCR技术，能够直接对牛奶样品中的牛无绿藻进行定性或定量测定，这是传统的病原分离及常规PCR技术所不能实现的，并且本方法只需要1个半小时就能出具结果，更加快捷简便。本发明还具有特异性好、灵敏度高、稳定性强的优点，在早期快速诊断牛无绿藻性乳腺炎方面具有明显的优势。

发明内容