[发明专利]一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种血浆外泌体提取试剂，具体的公开了一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用。本发明公开的技术方案与传统的超高速离心相比，样本中的外泌体所受到的压力较小，可以保持较完整的形态；本方案在传统非离子聚合物PEG的基础上添加了多聚赖氨酸一种带正电荷的氨基酸聚合物、poly‑lysine PEG Conjμgate、以及硫化物TCEP或者DTT，使得提取过程所需要的时间更短、所需要的样本起始量更低、提取效率更高，提取成本低。通过本方案获得的血浆外泌体可适用于多种下游实验，如RNA分析、高通量测序、细胞共培养等。

技术领域

本发明公开了一种血浆外泌体提取试剂，具体的公开了一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用。

背景技术

外泌体，是一种直径约30-150nm的双层脂膜囊泡状结构的分泌小体。大多数的真核细胞通过分泌作用都可以形成外泌体，细胞通过外泌体可以传递信号分子，包括蛋白质、脂类、以及核酸。在细胞间信号传导中，外泌体还可通过配体-受体识别作用，特异性结合靶细胞。目前外泌体提取方法主要有以下几种：超速离心法、磁珠免疫法、超滤法。

1.超速离心法是最常使用的外泌体提取方法。主要操作步骤如下：(1)低速离心(300xg)去除细胞；(2)高速离心(16,500xg)去除细胞碎片；(3)过0.22μm滤膜除去体积较大的分泌小体；(4)超速离心(120,000xg)沉淀外泌体。

超速离心方法的缺点：耗时，整个提取过程至少需要8-24小时；提取效率低，有文献报道，超速离心的外泌体提取效率仅为10％；设备要求高，常规实验室不具备超速离心的条件。

2.磁珠沉淀法：此方法通过偶联外泌体特异性抗体的磁珠与样本进行孵育，表达相应抗原的外泌体会被磁珠捕获并沉淀下来。外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。

磁珠沉淀方法的缺点：费用高，磁珠偶联抗体价格贵，一般仅能针对微量样本，不适用于大体积样本的外泌体提取；提取效率低，由于磁珠标记抗体的特异性，只能提取特异性表达相应抗原的外泌体，限制了该方法提取的效果；

3.超滤法：超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。超滤法的缺点：该方法通常需要结合超速离心，并且由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。

发明内容

针对上述情况，本发明公开了一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种血浆外泌体提取试剂，所述提取试剂包括非离子多聚物、硫化物、加入或者不加入盐。

进一步的，上述一种血浆外泌体提取试剂，所述非离子多聚物选自PEG、多聚赖氨酸、多聚赖氨酸PEG、DSS、PVP、硫酸葡聚糖中的一种或者多种；所述硫化物选自TCEP、DTT、巯基乙醇中的一种或者多种；所述盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化锰、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠的一种或多种。

进一步的，上述一种血浆外泌体提取试剂，所述的PEG分子量为5000-20000道尔顿，具体可以为5000道尔顿、8000道尔顿、10000道尔顿、20000道尔顿；所述PVP的分子量为10000-40000道尔顿，具体可以为10000道尔顿、25000道尔顿、38000道尔顿；所述的硫酸葡聚糖分子量为3000-50000道尔顿，具体可以为5000道尔顿、10000道尔顿、25000道尔顿、40000道尔顿；所述多聚赖氨酸的分子量为3万-30万道尔顿，具体可以为3万-7万道尔顿、7万-15万道尔顿、15万-30万道尔顿；所述多聚赖氨酸PEG为polylysine PEG Conjμgate,分子量为2000或者是polylysine PEG Conjμgate,分子量为5000。