[发明专利]一种高通量测定抗菌活性的方法

说明书

本发明提供了一种高通量测定抗菌活性的方法，属于抗菌活性检测技术领域；所述方法包括测定最低抑菌浓度、测定生长曲线、测定抑制率和测定生物膜活性中的一种或几种。本发明以96孔板为载体，测定待测样品和菌的混合液孵育过程中或者孵育后的吸光值，并以吸光值为依据，获得抗菌活性相关指标。使用本发明的方法进行抗菌活性的测定，能够一次对大量样本进行检测，极大的提高了实验效率，实现了高通量计数。

技术领域

本发明属于抗菌活性检测技术领域，具体涉及一种高通量测定抗菌活性的方法。

背景技术

抗菌活性是指抑制或杀灭病原微生物的能力，可用体外抑菌试验测定。体外抑菌实验是在体外测定微生物对某种物质的敏感程度的试验，常用于评价抑杀病原菌的活性，已广泛地应用与科研、生产和临床，如抗菌药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的测定、指导临床用药的药敏试验等。琼脂平板扩散法是目前最常用的方法之一。

传统的琼脂平板扩散法是将指示菌涂布于琼脂表面或均匀混入琼脂中，然后采用纸片法、牛津杯法、打孔法等方法加入待测物，让待测物在琼脂中扩散。由于琼脂无色透明、细菌无色半透明，导致细菌不生长的琼脂区域呈无色透明。若待测物有抗菌活性，其中的细菌等微生物生长受到抑制或杀灭，从而在药物有效浓度的范围内形成微生物不生长的透明圈，在光线较好的环境下辨别测量该透明圈的直径用于评价待测物有无抗菌活性及初步评价其活性大小。该透明圈称为抑菌圈，抑菌圈直径大小与抗菌物质浓度和指示菌浓度直接相关。但是传统的琼脂平板扩散法检测适合较少数量样本的检测，无法满足高通量检测的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高通量测定抗菌活性的方法，本发明的方法能够实现抗菌活性的高通量测定。

本发明提供了一种高通量测定抗菌活性的方法，包括测定最低抑菌浓度、测定生长曲线、测定抑制率和测定生物膜活性中的一种或几种；其特征在于，

所述测定最低抑菌浓度包括以下步骤：

在96孔板中对第一待测液进行第一孵育，观察96孔板的微孔中培养液的浑浊情况，以第一个出现澄清的培养液对应加入的第一待测液中待测样品的浓度作为待测样品对待测菌的最低抑菌浓度；所述第一待测液为待测菌菌液分别和不同已知浓度的待测样品的混合液；

所述测定生长曲线包括以下步骤：

21)在96孔板中对第二待测液进行第二孵育，每2h测定孵育体系在600nm处的吸光值，得到OD₆₀₀；所述第二待测液为待测菌菌液和待测样品的混合液；

22)以培养时间为横坐标，以OD₆₀₀为纵坐标，绘制待测菌的生长曲线；

所述测定抑制率包括以下步骤：

31)在96孔板中分别加入待测菌的阳性对照和第三待测液，进行第三孵育；所述第三待测液为待测菌菌液和待测样品的混合液；

32)对所述第三孵育的产物进行第一清洗后第一晾干，对所述第一晾干后的物质进行染色和第二清洗；

33)在所述第二清洗后的96孔板的微孔中加入乙醇水溶液，测定在595nm处的吸光值，按式I所示公式计算抑制率；

所述式I中A_对照为待测菌的阳性对照在595nm处的吸光值，A_样品为第三待测液在595nm处的吸光值；

所述测定生物膜活性包括以下步骤：

41)在96孔板中分别加入待测菌的阳性对照和第四待测液，进行第四孵育；所述第四待测液为待测菌菌液和待测样品的混合液；

42)对所述第四孵育的产物进行第三清洗后第二晾干，在所述第二晾干的96板的微孔中加入MTT溶液，进行第五孵育；