[发明专利]一种高通量测定抗菌活性的方法

权利要求书

1.一种高通量测定抗菌活性的方法，包括测定最低抑菌浓度、测定生长曲线、测定抑制率和测定生物膜活性中的一种或几种；其特征在于，

所述测定最低抑菌浓度包括以下步骤：

在96孔板中对第一待测液进行第一孵育，观察96孔板的微孔中培养液的浑浊情况，以第一个出现澄清的培养液对应加入的第一待测液中待测样品的浓度作为待测样品对待测菌的最低抑菌浓度；所述第一待测液为待测菌菌液分别和不同已知浓度的待测样品的混合液；

所述测定生长曲线包括以下步骤：

21)在96孔板中对第二待测液进行第二孵育，每2h测定孵育体系在600nm处的吸光值，得到OD₆₀₀；所述第二待测液为待测菌菌液和待测样品的混合液；

22)以培养时间为横坐标，以OD₆₀₀为纵坐标，绘制待测菌的生长曲线；

所述测定抑制率包括以下步骤：

31)在96孔板中分别加入待测菌的阳性对照和第三待测液，进行第三孵育；所述第三待测液为待测菌菌液和待测样品的混合液；

32)对所述第三孵育的产物进行第一清洗后第一晾干，对所述第一晾干后的物质进行染色和第二清洗；

33)在所述第二清洗后的96孔板的微孔中加入乙醇水溶液，测定在595nm处的吸光值，按式I所示公式计算抑制率；

所述式I中A_对照为待测菌的阳性对照在595nm处的吸光值，A_样品为第三待测液在595nm处的吸光值；

所述测定生物膜活性包括以下步骤：

41)在96孔板中分别加入待测菌的阳性对照和第四待测液，进行第四孵育；所述第四待测液为待测菌菌液和待测样品的混合液；

42)对所述第四孵育的产物进行第三清洗后第二晾干，在所述第二晾干的96板的微孔中加入MTT溶液，进行第五孵育；

43)在所述第五孵育后，去除上层培养基，加入二甲基亚砜溶液，测定在570nm处的吸光值，按式II所示公式计算生物膜活性；

所述式II中B_对照为待测菌的阳性对照在570nm处的吸光值，B_样品为第四待测液在570nm处的吸光值；

所述第三待测液的体积和待测菌的阳性对照的体积相同；所述第三待测液中待测菌菌液的含量和待测菌菌的阳性对照中待测菌菌液的含量相同；

所述第四待测液的体积和待测菌的阳性对照的体积相同；所述第四待测液中待测菌菌液的含量和待测菌菌的阳性对照中待测菌菌液的含量相同。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定抑制率还包括：在96孔板中对待测菌的阳性对照进行孵育，每2h测定在600nm处的吸光值，得到OD₆₀₀，得到OD₆₀₀后，以时间为x轴，吸光值为y轴，绘制最高抑制率下生物膜的形成量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二待测液所述第二待测液中待测样品包括多个浓度的样品，所述多个浓度的样品中包括最低抑菌浓度的待测样品，所述多个浓度的样品中包括最低抑菌浓度的待测样品。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测菌的阳性对照包括菌液和溶剂的混合液；所述溶剂包括甲醇水溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积浓度为80％～90％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测菌的阳性对照中菌液的浓度为1×10⁶CFU/mL～2×10⁶CFU/mL；所述菌液和溶剂的体积比为(4～5)：(15～16)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测菌包括大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定生长曲线中第二孵育的方式为震荡孵育，所述震荡的转速为1500～2000rpm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定生物膜活性中第五孵育的时间为4～6h。