[发明专利]基于流式细胞仪的微量细胞磷酸化蛋白表达的检测方法

说明书

本发明属于细胞胞内蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于流式细胞仪的微量细胞蛋白表达的检测方法。该检测方法是将待检测细胞与辅助沉降细胞混合后使用流式细胞检测仪检测所述待检测细胞的蛋白表达水平；所述辅助沉降细胞与所述待检测细胞大小不同。该检测方法可以对细胞起始量低(低至百级以下的细胞量)的样本进行胞内总蛋白和磷酸化蛋白的检测，对细胞来源困难的样本尤其适用。既可以大量节约起始细胞样本，又可以针对某些特殊样本里的微小细胞亚群进行分析。

技术领域

本发明属于细胞胞内蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于流式细胞仪的微量细胞磷酸化蛋白表达的检测方法。

背景技术

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在单细胞层面对生物大分子进行定性和定量分析，并可对特异细胞群体进行分选与富集，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞术能够快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集。与传统的荧光镜检查相比，流式细胞术可以高速分析上百万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。传统流式细胞术分析胞内蛋白表达水平，所需起始细胞数至少为10万级，对于发育，生殖以及干细胞研究领域，获取细胞难度大，细胞数少，难以用普通流式技术检测细胞内蛋白表达情况。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种基于流式细胞检测仪的微量细胞磷酸化蛋白表达的检测方法，该方法可以检测低至百级以下的细胞蛋白表达。

所述检测方法包括：将待检测细胞与辅助沉降细胞混合后使用流式细胞检测仪检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平。

优选地，所述辅助沉降细胞的阴性或阳性与所述待检测细胞的阴性或阳性相反，可以更进一步将辅助沉降细胞分离出来。

优选地，所述辅助沉降细胞选自能携带标记的细胞，也是为了后续更好的分离出所述辅助沉降细胞，

优选地，所述待检测细胞为小鼠骨髓细胞，所述辅助沉降细胞选择293T细胞；或所述待检测细胞为小鼠骨髓造血祖细胞，所述辅助沉降细胞选择293T细胞；或所述待检测细胞为GFP阴性K562细胞，所述辅助沉降细胞选择GFP阳性细胞；或所述待检测细胞为K562 细胞，所述辅助沉降细胞选择GFP阴性细胞；或所述待检测细胞为GFP阳性的K562细胞，所述辅助沉降细胞选择A2780细胞。

进一步，所述待检测细胞与所述辅助沉降细胞的比例为1：1-1：1000000。

优选地，所述检测方法包括以下步骤：

(1)将所述待检测细胞进行固定处理；

(2)将步骤(1)中固定后的待检测细胞与所述辅助沉降细胞进行混合；

(3)将步骤(2)得到的混合细胞进行通透处理；

(4)将步骤(3)通透处理后的混合细胞使用抗体进行标记并进行孵育；

(5)使用所述流式细胞检测仪去除所述辅助沉降细胞后检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平。

进一步，步骤(1)中，所述待检测细胞使用标记抗体标记后再进行固定；步骤(5)中，所述流式细胞检测仪去除所述辅助沉降细胞后，使用靶细胞特异性识别步骤(1)中的标记抗体，然后再检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平。

进一步，步骤(4)中，在某些实施例中，使用p-ERK抗体作为一抗进行标记，使用羊抗兔IgG-Alexa647作为二抗进行标记。

进一步，步骤(5)中，在检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平之前，根据细胞DNA倍数，排除不完整细胞的干扰。

优选地，所述检测方法适用于干细胞磷酸化总蛋白蛋白表达检测；或循环肿瘤细胞磷酸化蛋白表达检测。