[发明专利]一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法

说明书

本发明公开了一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，属于生物技术领域。本发明方法包括如下步骤：将假单胞菌ATCC 29574接种到2％BBL液体培养基中培养至细菌达到稳定期，离心收集菌体；取菌体，加入菌体裂解液，超声破碎使菌体破碎完全，离心取上清液，即分离到粗酶液；将粗酶液转移至超滤管中进行离心，收集超滤管的过滤器中的酶液；酶液通过以3‑吲哚丙烯酸偶联的氨基琼脂糖作为填料的亲和层析柱进行亲和层析，得到纯化的色氨酸侧基氧化酶。本发明通过亲和层析的方法，在层析柱上偶联上特异性的配体，使发酵液中的色氨酸侧基氧化酶与配体特异性结合，显著提高色氨酸侧基氧化酶的纯度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及蛋白的分离提纯，具体涉及一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法。

背景技术

色氨酸侧链氧化酶(Tryptophan side chain oxidase，TSO)是一种能作用于色氨酸侧链上的α碳原子并使其脱氢氧化的酶。它由3种同工酶组成，其相对分子质量分别为60kDa、44kDa、42kDa。其对多肽、蛋白质中的色氨酸及一些色氨酸类似物均能起到氧化作用。色氨酸侧基氧化酶主要是从一种假单胞菌(ATCC 29574)中分离得到，但目前没有一套系统、高效的方法对其进行分离提纯。

随着蛋白质分离纯化技术的发展，天然蛋白的纯化方法已由传统的大剂量、低纯度的盐析分离向小剂量、高纯度的自动化柱层析分离发展。AKTA蛋白纯化仪是一个搭载混合器、泵系统、电导检测器、UV检测器、pH检测器于一体的全自动化仪器，其具有便捷、高效、灵敏性高等特点。通过更换不同填料不同规格的层析柱可以满足蛋白质纯化过程中的不同工艺。因此广泛应用于生物样品的快速检测、分离、纯化，有效针对各种生物样品(如植物、动物、微生物)进行纯化分离特异性生物小分子，适合于实验室等小规模生产。

目前，假单胞菌ATCC 29574的全基因组测序尚未完成，无法通过其表达色氨酸侧基氧化酶的基因构建重组菌落。无法使用带有标签的抗体对其进行捕获。对于一种天然蛋白，通过传统的凝胶过滤层析能得到酶液。但由于仅通过蛋白质相对分子质量大小进行筛选，所得样品为一定相对分子质量范围内的全部蛋白质，其特异性差、灵敏度低、并且需要多次层析耗时耗力，最终样品纯度也较低。亲和层析是利用蛋白质与某些配体的相互作用进行特异性结合，分离非特异吸附物质，随后再改变缓冲液条件，将特异吸附在配基上的蛋白质解离下来，形成第二个层析峰。以此来分离目的蛋白与杂质。这种方法所得的蛋白质特异性高，样品纯度高，适用于纯度需求高的样品。通过连接不同的配基能够适用于分离提纯不同的物质。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法。通过本发明能够得到较高纯度的蛋白溶液，满足实验室小规模生产、实验室细胞实验以及动物实验使用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，包括如下步骤：

(1)将假单胞菌ATCC 29574接种到2％BBL液体培养基中培养至细菌达到稳定期，离心收集菌体。

(2)取菌体，加入菌体裂解液，超声破碎使菌体破碎完全，离心取上清液，即分离到粗酶液。

其中，所述的菌体裂解液的配方优选为：50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton-X，调pH至8.5-9.0。使用前加入苯甲基磺酰氟(PMSF)使其浓度为1μg/mL。

(3)将步骤(2)所得的粗酶液转移至超滤管中进行离心，收集超滤管的过滤器中的酶液。

(4)步骤(3)得到的酶液通过以3-吲哚丙烯酸偶联的氨基琼脂糖作为填料的亲和层析柱进行亲和层析，得到纯化的色氨酸侧基氧化酶。