[发明专利]一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法

权利要求书

1.一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将假单胞菌ATCC 29574接种到2％BBL液体培养基中培养至细菌达到稳定期，离心收集菌体；

(2)取菌体，加入菌体裂解液，超声破碎使菌体破碎完全，离心取上清液，即分离到粗酶液；

(3)将步骤(2)所得的粗酶液转移至超滤管中进行离心，收集超滤管的过滤器中的酶液；

(4)步骤(3)得到的酶液通过以3-吲哚丙烯酸偶联的氨基琼脂糖作为填料的亲和层析柱进行亲和层析，得到纯化的色氨酸侧基氧化酶。

2.根据权利要求1所述的一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，其特征在于：步骤(1)为：将冻藏的假单胞菌ATCC 29574接种至营养肉汤培养基中，在30℃、150rpm转速下培养24h；然后将接种菌液按1:20的比例加入至2％BBL液体培养基中，在30℃、200rpm转速下混合培养36h；在4℃、8000×g下离心1h，收集沉淀。

3.根据权利要求1所述的一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，其特征在于：步骤(2)中所述的菌体裂解液的配方为：50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton-X，调pH至8.5-9.0；使用前加入苯甲基磺酰氟使其浓度为1μg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，其特征在于：步骤(2)中，超声破碎在冰水浴下进行，超声破碎条件为：140W，工作10s，间歇10s，工作时间为30-40min；离心的条件为：4℃、10000×g离心30min。

5.根据权利要求1所述的一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，其特征在于：步骤(3)为：将步骤(2)中所得的粗酶液转移至Amicon Ultra-15 10K超滤管中，若粗酶液不满12mL，则加0.002M、pH 5.5的醋酸盐缓冲液补至12mL刻度线；将超滤管放入离心机中，滤膜面板朝上，4℃、4000×g离心40min；离心结束后倒去下层滤出液，收集过滤器中的酶液。

6.根据权利要求1所述的一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的3-吲哚丙烯酸偶联的氨基琼脂糖通过包括如下步骤的方法制备：

1)将3-吲哚丙烯酸、1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶于无水二甲基甲酰胺中，将混合液震荡反应，生成一种淡黄色的酯类物质；

2)将氨基琼脂糖用0.1M、pH 8.5的磷酸盐缓冲液平衡，随后按1:20的比例将步骤1)所得酯类物质加入到平衡后的氨基琼脂糖中，振荡反应得到3-吲哚丙烯酸偶联的氨基琼脂糖。

7.根据权利要求1所述的一种色氨酸侧基氧化酶的分离提纯方法，其特征在于：步骤(4)采用AKTA蛋白纯化仪进行，用0.002M、pH 5.5的醋酸盐缓冲液平衡亲和层析柱至流出液A₂₈₀小于50mAU；平衡后，用0.002M、pH 5.5的醋酸盐缓冲液将样品环中的酶液推至亲和层析柱；随后分别用浓度为0.002M、0.05M、0.2M的pH 5.5的醋酸盐缓冲液洗脱至A₂₈₀小于50mAU，收集每个梯度浓度的醋酸盐缓冲液的洗脱液。