[发明专利]酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用

说明书

本发明公开了一种编码短链脱氢酶的基因能催化葫芦二烯醇生成葫芦素中间体cucurbita‑5‑24‑dien‑3‑one，该酶在葫芦二烯醇的C3位进行脱氢反应形成酮基，形成多数葫芦素的骨架，这极大地推动了对葫芦素生物合成分子机理的认知，也将为葫芦素的全合成奠定基础。目前来源于雪胆、南瓜、西瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜等16种葫芦科植物的短链脱氢酶已经被成功克隆验证功能，并使用来源于雪胆的HcSDR1基因，采用酵母同源重组组装构建酿酒酵母底盘细胞生产目标化合物cucurbita‑5‑24‑dien‑3‑one。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的应用。

背景技术

葫芦素(Cucurbitacin)是一种广泛分布于葫芦科多种植物中葫芦烷型四环三萜类化合物，药理活性研宄表明其葫芦素具有显著的抗炎、抗肿瘤作用。葫芦素已被报道具有良好的抗癌活性，其中葫芦素B、D和葫芦素E、I细胞毒性显著。通过特异阻断肿瘤细胞生长所需的JAK-STAT信号通路来抑制肝癌、膀胱癌、胰腺癌等癌细胞的扩散，可与其他抗癌药物一块使用，提高癌症治疗的效果。此外，各种葫芦素还具有显著的降血糖作用，例如来自苦瓜中的葫芦烷糖苷和苦瓜苷。雪胆属植物块茎中富含葫芦素类和其他三萜皂苷成分，具有清热解毒、抗菌消炎等多种功效，临床上用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎及急性扁桃体炎等多种疾病。

合成生物学方法是生产药效单体的重要途径。近年来，运用合成生物学策略可实现植物天然产物单体异源重建和生产，越来越多的药用活性成分在在微生物细胞和植物中实现了生物合成，为药效单体的工业化生产提供了可能，如紫杉醇前体、青蒿素前体青蒿酸、人参皂苷及其前体。最近还报道了莨菪烷类生物碱在酵母中的全合成，烟草中几乎完整的秋水仙碱异源生物合成途径。异源合成天然产物的关键在于生物合成途径的完全解析，这将直接影响其是否能从头合成。葫芦素仅见前体葫芦二烯醇的异源高效合成的报道，至今尚无代谢工程生产葫芦素单体的报道，这主要是对其完整生物合成途径缺乏了解。

葫芦素可根据化学结构分为12类，即葫芦素A～T；而且其分布有明显的物种特异性，如葫芦素A仅分布于黄瓜属(Cucumis)植物中，葫芦素C则仅存在于黄瓜(Cucumissativus L.)中；同样地，葫芦素F特异地存在于雪胆属(Hemsleya)植物中。葫芦素种类众多，分布有物种特异性，同时除少数植物(如Citrullus colocynthis)积累高含量的少数种类葫芦素单体外，多数植物葫芦素含量均非常低。雪胆属植物中雪胆甲素(cucurbitacinIIa)和雪胆乙素(cucurbitacin IIb)含量都非常低，而且仅能在4年以上植株块茎中检测到，即便是含量最高的盘龙七(H.panlongqi)中二者的含量也仅分别为0.46mg/g和4.37mg/g。因此，通过合成生物学方法异源合成单体葫芦素无疑将是我们必然选择。

近年来，发现葫芦素羟化修饰的关键CYP是相关研究的热点之一。前人发现黄瓜7个CYP参与葫芦素生物合成，但仅3个的功能得到验证。其中，CYP88L2是C19羟化酶，CYP81Q58则催化C25位羟化和C-C双键的转移；多功能的CYP87D20则连续地催化Cuol的C11氧化和C20位羟化，接下来，CYP81Q59催化其C2位的β羟化(图1)。

综上所述，尽管催化葫芦素部分位点羟化(C-2，C-3，C-19，C-20β-OH，C-25)以及C-11酮基合成的分子机理和相关基因已经被阐明，但是仍然有以下关键问题尚未解决：(1)C-3酮基者或者C-3α羟基(葫芦素F)；(2)C-22酮基；(3)C-16α羟基。通常植物三萜的C-3位是由2,3-氧化鲨烯环化而来β-OH，但12类葫芦素中只有葫芦素C的C-3位为β-OH，其他均为酮基，少数特异为或删除α-OH，如葫芦素F和P，这是葫芦素区别于其他三萜化合物的典型特征之一。

负责C3位酮基化修饰催化酶基因没被挖掘鉴定出来，其中主要包括氧化还原酶，比如CYP450酶、短链脱氢酶等；同时，C-3位为酮基的葫芦素中间体也没有报道和生物合成。

发明内容