[发明专利]酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用

权利要求书

1.一种酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：利用组成型启动子HXT7p、TEF2 p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p、TEF1p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t、PGK1t控制tHMG1、synHcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9、synHcOSC6和synHcSDR基因的表达，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块，运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one生物合成途径的酿酒酵母工程菌。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：每一种所述基因表达盒的构建是通过两步重叠延伸PCR的方法连接的，多个基因表达盒通过酵母同源重组系统重组至酵母基因组的δDNA位点。

3.根据权利要求2所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述酵母基因组的提取方法包括以下步骤：取酿酒酵母BY4742菌斑于YPD培养基中培养，收集菌体清洗，重悬于酵母破壁液后，用TENTS缓冲液重悬，然后用酚/氯仿抽提，上清液中加入乙醇和醋酸钠溶液放置，离心，得沉淀；所述沉淀用乙醇洗涤，干燥，双蒸水溶解，得到酵母基因组DNA。

4.根据权利要求3所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述YPD培养基选自YPD液体培养基或YPD固体培养基；所述YPD液体培养基包括以下质量百分比的组份：酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％和余量的水；所述YPD固体培养基包括以下质量百分比的组份：酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、琼脂粉2％和余量的水。

5.根据权利要求3所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述培养的条件为：在温度30℃的条件下，200rpm/min、摇瓶振荡培养24小时；所述酵母破壁液包括以下组分：酵母破壁酶25ul、山梨醇缓冲液470ul、B-ME5ul。

6.根据权利要求2所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述基因表达盒的构建方法包括以下步骤：将每个所述的启动子、基因、终止子，营养选择标记和同源臂进行PCR扩增，分别用引物扩增获得功能模块，进行基因扩增；在所述PCR扩增结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收，得到基本片段；使用相邻的2–4个所述基本片段作为模板，进行融合PCR，得到每个融合片段构建形成基因表达盒。

7.根据权利要求6所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增反应体系为94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。

8.一种采用权利要求1-7任一种所述酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的应用。

9.一种采用权利要求1-7任一种所述酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：将酿酒酵母工程菌于SC-LEU液体筛选培养基中制备发酵种子液，离心收集菌体，将所述菌体转移至所述YPD液体培养基中培养，得到发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用甲醇静泡，超声提取，离心收集细胞菌体，取上清液检测产物。

10.一种采用权利要求1-7任一种所述酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：将酿酒酵母工程菌于YPD液体培养基中制备发酵种子液，将所述发酵种子液转移至所述YPD液体培养基中发酵，得发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用裂解液孵育，超声提取，然后用石油醚萃取，得到产物。