[发明专利]一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种靶向PD‑1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用，包括以下步骤：人和小鼠PD‑1 mRNA序列信息的获取；人和小鼠PD‑1 mRNA保守序列的筛选；人和小鼠PD‑1 mRNA保守序列的二级结构预测；人和小鼠PD‑1 mRNA保守序列内部稳定性分析；ASO的二级结构预测和分子间/分子内能量分析；ASO与靶区mRNA结合的能量分析；ASO的评分；步骤八、ASO的合成。本发明通过网络数据库和生物信息软件，以人和小鼠PD‑1 mRNA的保守序列为靶点，设计了一系列靶向PD‑1 mRNA的候选ASOs，并通过生物信息软件对其进行分析，初步筛选出形成分子间或分子内二级结构所需的自由能较高、与靶区mRNA结合所需的自由能较低、且不易非特异性地结合其他与PD‑1无关的mRNA的ASOs，在灭活病毒疫苗或重组亚单位疫苗中发挥佐剂效应。

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体为一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用。

背景技术

接种疫苗是预防感染性疾病最有效的措施，疫苗包括任何用作预防接种来刺激机体产生针对特定疾病的免疫反应的物质，佐剂作为疫苗的重要组分，被用于增强和/或塑造抗原特异性免疫反应。传统的疫苗例如灭活疫苗或减毒活疫苗，虽然有效并且有良好的免疫原性，但是存在着一定的安全隐患。因此，更加安全的亚单位疫苗被开发并得到了广泛的应用，但是亚单位疫苗的免疫效果和免疫原性通常较弱，因此，新型佐剂的开发和使用在新型疫苗中尤为重要。

现有的佐剂大致可分为三类:递送系统、免疫调节分子及兼具前两者性质的混合佐剂，尽管作用机制有所不同，但都是通过刺激免疫激活信号而起到增强免疫反应的作用的，尚未有通过抑制免疫抑制信号而发挥增强免疫反应的佐剂。CTLA-4是表达在活化的T细胞表面的一种重要的免疫卡点分子，它可以通过阻断CD28介导的共刺激信号而对T细胞的活化发挥抑制作用。验证结果表明CTLA-4 mRNA 3’UTR的靶向性ASO可以通过抑制CTLA-4介导的免疫抑制性信号，促进T细胞依赖的抗体应答，从而在灭活病毒疫苗和重组亚单位疫苗中发挥增强抗体水平的佐剂效应，这提示了对免疫抑制性信号的负性调节可成为研制新型疫苗佐剂的新策略。

CTLA-4主要在免疫应答初期抑制naïve T细胞的早期活化，与CTLA-4不同，另一种抑制性免疫卡点分子程序性细胞死亡受体 1（Programmed cell death 1，PD-1）主要在免疫应答的晚期被诱导表达在效应T细胞上，来限制T细胞在外周组织中发挥功能。PD-1可以通过与其配体PD-L1和PD-L2相互作用，抑制T细胞的活化、增殖并促进T细胞的凋亡。不仅如此，PD-1也可以通过促进CD8+ T细胞的失能和耗竭而参与到慢性病毒感染中，验证表明抑制PD-1可以恢复CD8+ T细胞的功能及细胞毒性作用。因此，推测与CTLA-4相比，阻断PD-1可以通过促进病毒的清除而更好的控制和预防病毒引起的感染性疾病，PD-1抑制剂可能在抗病毒疫苗中可能会发挥更好的疫苗佐剂作用。为此，提出了一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用，通过网络数据库和生物信息软件，以人和小鼠PD-1 mRNA的保守序列为靶点，设计了一系列靶向PD-1 mRNA的候选ASOs，并通过生物信息软件对其进行分析，初步筛选出形成分子间或分子内二级结构所需的自由能较高、与靶区mRNA结合所需的自由能较低、且不易非特异性地结合其他与PD-1无关的mRNA的ASOs（Aspd-1、Aspd-12及Aspd-13），可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

作为本发明的一个方面，一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，包括以下步骤：

步骤一、人和小鼠PD-1 mRNA序列信息的获取，在美国国立生物技术信息中心Nucleotide数据库中，以“PD-1”为检索词，检索人和小鼠PD-1 mRNA的序列信息；