[发明专利]一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用

权利要求书

1.一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、人和小鼠PD-1 mRNA序列信息的获取，在美国国立生物技术信息中心Nucleotide数据库中，以“PD-1”为检索词，检索人和小鼠PD-1 mRNA的序列信息；

步骤二、人和小鼠PD-1 mRNA保守序列的筛选，利用DNASTAR Lasergene序列分析软件中的子软件“MegAlign”对人和小鼠PD-1 mRNA的序列进行比对，以筛选二者的保守序列；

步骤三、人和小鼠PD-1 mRNA保守序列的二级结构预测，利用Sfold在线分析软件中的Srna功能对人和小鼠PD-1 mRNA的二级结构进行预测，检测保守序列中未配对的碱基数，以判断这三段保守序列成为ASO设计靶区的可能性；

步骤四、人和小鼠PD-1 mRNA保守序列内部稳定性分析，利用Oligo分析软件对人和小鼠PD-1 mRNA的保守序列的内部稳定性进行分析；

步骤五、ASO的二级结构预测和分子间/分子内能量分析，利用Oligo分析软件对PD-1mRNA候选靶向性ASO的二级结构进行预测；

步骤六、ASO与靶区mRNA结合的能量分析，利用Sfold在线分析软件中的Soligo功能对候选ASOs与其靶区mRNA结合的能量进行分析；

步骤七、ASO的评分，以ASO的分子间/分子内自由能及ASO与靶区mRNA结合的自由能为重要参数，对候选ASOs进行了评分；

步骤八、ASO的合成。

2.根据权利要求1所述的一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤二中，人和小鼠PD-1 mRNA保守序列的筛选方法，如下：从“File”菜单中，选择“Enter Sequences”选项，输入人和小鼠PD-1 mRNA的核苷酸序列；同时选中人和小鼠PD-1mRNA的核苷酸序列，从“Align”菜单中的“One Pair”选择“Wilbur-Lipman”配对比较方法对这两个序列进行对比分析；从显示比较结果的窗口，找出匹配的序列即为人和小鼠PD-1mRNA的保守序列。

3.根据权利要求1所述的一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤四中，人和小鼠PD-1 mRNA保守序列内部稳定性分析方法，如下：从“File”菜单中，选择“New Sequence”选项，输入人或小鼠PD-1 mRNA的核苷酸序列；在“Internalstability”结果窗口中检索保守序列对应的内部自由能。

4.根据权利要求1所述的一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤五中，ASO的二级结构预测和分子间/分子内能量分析方法，如下：从“Edit”菜单中，选择“Upper Primer”或“Lower Primer”选项，输入候选ASO的序列；从“Analyze”菜单中，“Duplex Formation”或“Hairpin Formation”选项，对候选ASOs分子间形成的二聚体结构及分子内部形成的发夹结构进行及分子间/分子内的自由能进行分析。

5.根据权利要求1所述的一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤七中，对候选ASOs的评分方法，如下：

（1）将1~15号ASOs按照分子间自由能由高到低排序、分子内自由能由高到低排序、靶区mRNA结合能量由低到高排序；

（2）按照排序的1~15分别计为15~1分，将分子间自由能得分、分子内自由能得分、与靶区mRNA结合能量得分计算总和，作为ASO的综合得分；

（3）按照综合得分将ASOs进行排序；

（4）筛选出得分最高的三个ASOs作为最终的PD-1 mRNA靶向性ASO。