[发明专利]Bsu聚合酶介导的荧光编码传感器及其在8-oxo-7,8-二氢鸟嘌呤检测中的应用

说明书

本发明属于荧光检测技术领域，提供Bsu聚合酶介导的荧光编码传感器及其在8‑oxo‑7,8‑二氢鸟嘌呤检测中的应用。所述荧光编码传感器至少包括DNA捕获探针，Bsu聚合酶和荧光基团修饰的dATP。本发明设计的Bsu聚合酶介导的荧光编码传感器利用Bsu聚合酶的高延伸能力、高分别能力，可以准确测定端粒特异性位点上的氧化损伤；利用磁珠的高分离效率有效降低了背景信号；同时单分子检测灵敏度极高、样品消耗量少，此外，还可以准确量化过氧化氢处理的HeLa细胞提取的基因组DNA中的OG，在疾病特异性基因损伤研究和早期临床诊断方面具有巨大的潜力。

技术领域

本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及Bsu聚合酶介导的荧光编码传感器及其在8-oxo-7,8-二氢鸟嘌呤检测中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

活性氧(ROS)是由内源性因素(如细胞代谢)、外源性刺激(如紫外线辐射和电离辐射)和环境毒素产生的。ROS可以氧化核酸等细胞大分子从而产生单个碱基损伤和DNA链断裂，它们能改变基因表达和调控，损害基因组稳定性，促进衰老和癌变。鸟嘌呤(G)由于其氧化还原电位最低，在4个DNA碱基中最容易被氧化。G主要的氧化产物之一是8-oxo-7,8-二氢鸟嘌呤(OG)，OG可以发生在染色体DNA的任何部分，包括保护染色体末端的端粒。此外，G的氧化电位在单链的叠加时降低，促进GGG三联体陷阱进行空穴转移，并作为氧化还原反应的优先位点。OG与端粒长度和完整性的变化有关，并可能导致端粒缩短、功能障碍、细胞衰老，甚至是癌症。因此，端粒中OG的鉴定对研究遗传毒性至关重要。

传统的OG检测方法包括高效液相色谱法(HPLC)和HPLC与气相色谱-质谱法(GC-MS)相结合，但是他们都需要复杂的仪器和繁琐的程序，或在高温下长时间培养以进行气相色谱-质谱分析。单细胞凝胶电泳对细胞OG水平的检测具有成本效益，但不能提供定量信息。近年来，对OG具有良好特异性的酶被用于启动DNA碱基切除修复途径并去除OG，留下一个无嘌呤位点，可以被裂解酶转化为DNA断裂。合成的DNA断裂可以通过PCR和下一代测序来测量，但发明人发现，这些方法涉及多种酶反应，不能量化特定序列中的OG水平。因此，敏感地检测特定序列中的低丰度OG水平仍然是一个巨大的挑战。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种Bsu聚合酶介导的荧光编码传感器及其在8-oxo-7,8-二氢鸟嘌呤检测中的应用。本发明设计的Bsu聚合酶介导的荧光编码传感器利用Bsu聚合酶的高延伸能力、高分别能力，可以准确测定端粒特异性位点上的氧化损伤；利用磁珠的高分离效率有效降低了背景信号；同时单分子检测灵敏度极高、样品消耗量少，此外，还可以准确量化过氧化氢处理的HeLa细胞提取的基因组DNA中的OG，在疾病特异性基因损伤研究和早期临床诊断方面具有巨大的潜力。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种Bsu聚合酶介导的荧光编码传感器，所述荧光编码传感器至少包括DNA捕获探针，Bsu聚合酶和荧光基团修饰的dATP；

其中，所述DNA捕获探针具有与待测序列杂交的互补区域，从而可以与待测序列杂交形成部分双链结构；但其并不包含与OG位点互补配对的碱基序列。

所述DNA捕获探针5'末端修饰有生物素，从而可以与链霉亲和素包被的磁珠(MB)结合；

由于在所有聚合酶中，Bsu聚合酶在单核苷酸引物延伸反应中对OG和G的鉴别能力最大(34.1倍)，因此选择Bsu聚合酶用于端粒-OG的区分和编码。