[发明专利]一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法

说明书

本发明涉及一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法，属于细胞培养技术领域。本发明中所述的制备方法包括如下步骤：(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，传代纯化1～3次得到纯度为100％的绵羊皮肤成纤维细胞。按照本发明的制备方法制备得到的绵羊成纤维细胞的纯度高，能达100％，可以稳定传代。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。

背景技术

成纤维细胞是结缔组织的主要细胞成分，也被称为纤维母细胞，广泛应用于动物基因功能、医药开发和胚胎技术研究等多个领域，通常单个细胞呈长纺锤形或不规则扁平状，细胞核在细胞中清晰可见呈规则圆形，胞质突起生长呈放射状。体外培养过程中成纤维细胞大多呈梭型、多角形和扁平星型。成纤维细胞体积大、数量多，具有较强的分裂增殖能力，活动旺盛，易培养。

皮肤成纤维细胞与羊毛生长发育密切相关，还是诸多羊毛生长发育相关基因体外功能研究的重要载体，因此对绵羊成纤维细胞的分离培养研究是羊毛发育机制以及绵羊育种研究的重要内容。

目前对绵羊皮肤成纤维细胞的分离培养方法文献较少，已有文献报道的绵羊成纤维细胞分离培养方法主要是取自绵羊早期胚胎组织，用胰蛋白酶消化法，离心去上清重悬培养。但该方法培养效果极不稳定，消化液的浓度和消化时间较难掌控，消化得到的细胞量较少且培养周期较长，需10天左右方可传代，最终获得的细胞活性较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种绵羊皮肤成纤维细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；

(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；

(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，得到绵羊皮肤成纤维细胞。

作为优选，所述绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织；

所述绵羊耳部皮肤组织来源于出生后10～14h的绵羊；

所述绵羊耳部皮肤组织为去除软骨后的组织。

作为优选，步骤(1)和步骤(2)中所述胰蛋白酶的浓度独立为0.2～0.3wt％；

步骤(1)所述绵羊皮肤组织与胰蛋白酶的质量体积比为1～1.5g:2mL；

所述Ⅰ型胶原酶消化时的终浓度为2～3mg/mL。

作为优选，步骤(1)所述胰蛋白酶消化的温度和Ⅰ型胶原酶消化的温度独立为36～38℃；

步骤(1)所述离心的转速为1300～1500rpm；

所述离心的时间为10～12min。

作为优选，步骤(2)和步骤(3)所述培养的温度独立为36～38℃；

所述培养的CO₂的浓度独立为4.5～5.5vt％。

作为优选，步骤(2)和步骤(3)所述培养的时间独立为46～50h。