[发明专利]一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种绵羊皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用胰蛋白酶对离体绵羊皮肤组织消化30～40min后，再用Ⅰ型胶原酶消化3～4h后，离心，取沉淀，得到消化细胞；

(2)将所述消化细胞接种至DMEM高糖培养基中培养至细胞汇合度为70～80％时，用胰蛋白酶消化1～2min后，离心，得第一次纯化的细胞；

(3)将所述第一次纯化的细胞接种至DMEM高糖培养基中，培养至细胞汇合度为85～95％时，得到绵羊皮肤成纤维细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织；

所述绵羊耳部皮肤组织来源于出生后10～14h的绵羊；

所述绵羊耳部皮肤组织为去除软骨后的组织。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述胰蛋白酶的浓度独立为0.2～0.3wt％；

步骤(1)所述绵羊皮肤组织与胰蛋白酶的质量体积比为1～1.5g:2mL；

所述Ⅰ型胶原酶消化时的终浓度为2～3mg/mL。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述胰蛋白酶消化的温度和Ⅰ型胶原酶消化的温度独立为36～38℃；

步骤(1)所述离心的转速为1300～1500rpm；

所述离心的时间为10～12min。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述培养的温度独立为36～38℃；

所述培养的CO₂的浓度独立为4.5～5.5vt％。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述培养的时间独立为46～50h。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的转速为800～1000rpm；

所述离心的时间为4～5min。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述DMEM高糖培养基中还包括如下体积浓度的组分：18～22％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括传代纯化步骤；

所述传代纯化的方法为重复操作步骤(2)和步骤(3)所述的方法；

所述传代纯化的次数为1～3次；

所述传代纯化的培养基为DMEM高糖培养基；

所述DMEM高糖培养基还包括如下体积浓度的组分：8～12％胎牛血清、0.8～1.2％青霉素、0.8～1.2％链霉素、0.8～1.2％两性霉素。

10.权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备得到的绵羊皮肤成纤维细胞，其特征在于，所述绵羊皮肤成纤维细胞的纯度≥85％。