[发明专利]一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法

说明书

本发明公开了一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，以绿樱花优良株系组培再生芽为材料，通过茎尖剥取、预处理、装载、玻璃化处理与小液滴制作、超低温保存、卸载及恢复培养等步骤。本发明建立的一种樱花组培再生芽离体保存的方法，是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存绿樱花御衣黄优良种质资源的方法，超低温保存后御衣黄茎尖成活率高达62.3％，茎尖再生率为56.4％。

技术领域

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体涉及一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法。

背景技术

绿樱花-“御衣黄”为蔷薇科樱属多年生木本景观植物，集观叶、观花及观型于一身。其叶色具有明显的季相变化，其花淡绿色，花开繁密，花期较长，是自然界中为数不多开着绿色花朵的乔木，属珍稀樱花品种，具有极高的经济和观赏价值，在园林绿化中应用前景广阔。

目前，有关御衣黄的研究主要集中在栽培技术方面，有关其组织培养目前有少量报道，但有关其组培苗离体超低温保存技术研究未见报道。众所周知，利用组培快繁技术对植物种质资源的保存具有一定的优势，如申请号为 CN201810646121.1的专利公开了一种日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法。但由于存在保存过程繁琐、保存成本较高、且随着保存时间的延长和继代次数的增加，保存的材料易受到污染的干扰等问题，因此，该技术仅局限于实验室中对研究材料的保存。超低温保存技术作为一种新型保存技术，是以液氮(-196℃) 为冷源，生物材料保存在如此低温条件下，活细胞内的代谢活动几乎完全停止，因此保存过程中材料细胞的活力、形态发生的全能性及遗传稳定性不受影响，是目前公认的长期而稳定的保存植物种质资源的理想方法。现已开发出多种植物资源的超低温保存的技术，然而对于不同物种甚至对于同一物种的不同品种，其适宜的超低温保存技术都存在很大差异。目前在组织培养基础上，有关利用超低温保存技术对绿樱花种质资源进行保存的研究尚未见报道。因此，急需开发一种樱花组培再生芽离体保存的方法，以满足对绿樱花优良株系组培苗种质保存的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于如何满足对绿樱花优良株系组培苗种质保存的需求。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，包括以下步骤：

(1)取材：以具有优良农艺性状的绿樱花的组培再生芽为材料来源，剥取适宜大小的茎尖作为外植体，备用；

(2)茎尖预处理：将剥取的茎尖接种于高渗培养基中于适宜的条件下进行预培养；

(3)茎尖装载处理：将预处理的茎尖，转到装有装载液的2mL无菌离心管中进行装载处理；

(4)玻璃化处理和小液滴制作：将装载处理后的茎尖，转至装有改良无菌 PVS2溶液的无菌离心管中进行玻璃化处理；然后将茎尖转至无菌锡箔纸上并用改良PVS2小液滴覆盖；

(5)超低温保存：将制作好的含有茎尖小液滴的锡箔纸条置于液氮中进行速冻处理；

(6)卸载处理：将液氮保存的茎尖放置于卸载液中解冻和洗涤处理；

(7)恢复培养：将卸载处理后的茎尖接种于恢复培养基进行再生培养，最终获得完整再生植株。

本发明的一种樱花组培再生芽离体保存的方法，是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存绿樱花御衣黄优良种质资源的方法，超低温保存后御衣黄茎尖成活率高达62.3％，茎尖再生率为56.4％。

本发明以绿樱花组培再生不定芽茎尖为超低温保存材料，一方面取材方便，材料丰富；另一方面由于茎尖含有茎尖分生组织，细胞再生能力较强，遗传稳定性高；此外，在利用茎尖对绿樱花种质资源进行超低温保存的同时可获得脱病毒植株，是一种很有前景的绿樱花植株脱毒新技术。