[发明专利]一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法

权利要求书

1.一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取材：以具有优良农艺性状的绿樱花的组培再生芽为材料来源，剥取适宜大小的茎尖作为外植体，备用；

(2)茎尖预处理：将剥取的茎尖接种于高渗培养基中于适宜的条件下进行预培养；

(3)茎尖装载处理：将预处理的茎尖，转到装有装载液的2mL无菌离心管中进行装载处理；

(4)玻璃化处理和小液滴制作：将装载处理后的茎尖，转至装有改良无菌PVS2溶液的无菌离心管中进行玻璃化处理；然后将茎尖转至无菌锡箔纸上并用改良PVS2小液滴覆盖；

(5)超低温保存：将制作好的含有茎尖小液滴的锡箔纸条置于液氮中进行速冻处理；

(6)卸载处理：将液氮保存的茎尖放置于卸载液中解冻和洗涤处理；

(7)恢复培养：将卸载处理后的茎尖接种于恢复培养基进行再生培养，最终获得完整再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述的取材具体是指：在无菌条件下，从绿樱花-御衣黄优良株系茎段诱导的不定芽丛上剥取直径大小为1-3mm的茎尖。

3.根据权利要求1所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述的茎尖预处理具体是指：将茎尖接种于添加有0.3-0.5M甘露醇的DKW培养基上于4℃恒温培养箱黑暗培养1-3d。

4.根据权利要求1所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述的茎尖装载处理具体是指：将预处理后的茎尖转接于添加有2M甘油、0.4M蔗糖和10-50μM褪黑素的MS液体培养基中于0℃条件下处理20-40min。

5.根据权利要求1所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述的玻璃化处理与小液滴制作具体是指：将装载处理后的茎尖转接于改良PVS2溶液中于0℃处理1-5h，然后将茎尖转至3.0cm长的锡箔纸条上并用改良PVS2小液滴覆盖，每个茎尖滴12-15μL改良PVS2溶液，每个锡箔纸条上放置3-4个茎尖。

6.根据权利要求5所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述的改良PVS2溶液为添加有10-50μM褪黑素、30％甘油、15％乙二醇、15％二甲亚砜和0.4M蔗糖的MS液体培养基。

7.根据权利要求1所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述的超低温保存具体具体是指：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箔条置于2mL冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮中保存。

8.根据权利要求1所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述的卸载处理具体是指：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于卸载液中于35-40℃水浴条件下进行解冻和洗涤，洗涤茎尖2-3次，每次洗涤时间3-12min。

9.根据权利要求8所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述卸载液为终浓度为1.2M蔗糖的MS液体培养基。

10.根据权利要求1所述的一种绿樱花组培再生芽离体保存的方法，其特征在于：所述的恢复培养具体是指：将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于添加有0.01-0.1mg/L TDZ，0.1-0.5mg/L 6-BA，3％蔗糖和0.7％琼脂的DKW培养基中于温度为25±2℃的恒温培养室黑暗培养5-10d，然后转至光照强度为40μmol·m^-2·s^-2，光照时间为14h，温度为25±2℃的恒温培养室进行植株再生培养。