[发明专利]一种β-葡聚糖合成酶活力的检测试剂盒、检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种β‑葡聚糖合成酶活力的检测试剂盒、检测方法及应用，属于酶技术领域；本发明中，所述用于测定β‑葡聚糖合成酶活力的试剂盒，主要包括具有水解尿苷二磷酸(UDP)释放磷酸根的外核苷三磷酸二磷酸水解酶(ENTDP)和测定所释放的磷酸根含量的试剂；所述测定β‑葡聚糖合成酶活力的试剂盒可以快速准确地测定β‑葡聚糖合成酶以UDP‑葡萄糖为底物合成β‑葡聚糖糖链过程中形成的副产物尿苷二磷酸(UDP)的含量，据此准确计算其活力；所述测定β‑葡聚糖合成酶活力的试剂盒和测定方法具有设备要求低、操作安全简便、灵敏度高、低成本等明显优势。

技术领域

本发明属于酶技术领域，具体涉及一种β-葡聚糖合成酶活力的检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

葡聚糖(Glucan)是一大类由α/β-1,3、1,4或1,6-糖苷键连接葡萄糖单体形成的大分子多聚体，其作为植物和真菌细胞壁的重要结构组分之一，为维持细胞形状和完整性、保护细胞免受内部膨胀压力和外部其它环境影响等发挥关键作用。近年来研究表明，真菌来源的β-1,3、1,4或1,6-葡聚糖具有显著的免疫增强、调节肠道菌群、降血糖等功能，现已成为食药用真菌产品的主要指标性成分之一。葡聚糖的免疫调节活性因其化学组成、构型和物理性质的不同而有很大不同。以β-1,3-为主链、以β-1,6-为支链的多糖活性最为显著。

一般认为，真菌或植物中β-葡聚糖合成过程可能涉及以下主要步骤：(1)葡萄糖通过载体蛋白运输进入细胞内，经葡萄糖激酶催化成6-磷酸葡萄糖，再被磷酸葡萄糖变位酶催化成1-磷酸葡萄糖；(2)1-磷酸葡萄糖经UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的催化作用下成UDP-葡萄糖；(3)RHO1激活的葡聚糖合成酶(Glucan synthase,GLS,不同真菌可能有多个GLS参与葡聚糖的合成)以UDP-葡萄糖为底物，将其链接形成不同聚合度的β-葡聚糖。β-葡聚糖合成酶催化UDP-葡萄糖合成β-葡聚糖糖链的反应过程为：[β-(1→3)-D-glucosyl]_(n)+UDP-α-D-glucose＝[β-(1→3)-D-glucosyl]_(n+1)+H⁺+UDP，因此，β-葡聚糖合成酶对β-葡聚糖的合成具有至关重要的作用，准确测定β-葡聚糖合成酶的酶活是理解β-葡聚糖合成途径以及合成产物的关键步骤。

目前，β-葡聚糖合成酶活的检测方法主要以放射性同位素标记的UDP-[¹⁴C]葡萄糖为底物，通过使用液体闪烁计数仪测定UDP-[¹⁴C]葡萄糖的放射活性变化，推测转移的葡聚糖链的聚合度，据此确定β-葡聚糖合成酶的活力；然而，该方法需要昂贵的底物(同位素标记的UDP-[¹⁴C]葡萄糖)、专业检测仪器(液体闪烁计数仪)，实验成本极高；同时，放射性底物UDP-[¹⁴C]具有一定的危险性，增加了对实验人员辐射危害。Esther Shedletzky等建立了一种β-葡聚糖合成酶活的测定方法，其以UDP-葡萄糖作为底物反应后，加入放射性苯胺蓝作为荧光染色剂与合成的β-葡聚糖糖链结合，通过测定染色结果计算β-葡聚糖合成酶的活力；该方法无需放射性的底物UDP-[¹⁴C]葡萄糖，也无需处理合成的β-葡聚糖产物，一定程度上简化了β-葡聚糖合成酶活测定操作步骤；但检测灵敏度不足，并且具有放射性的苯胺蓝作为荧光染色剂，实验成本仍比较高，也存在一定的不安全性。所以，亟待探索一种操作安全、低成本、便捷高效的β-葡聚糖合成酶活力的检测方法。

发明内容

本发明目的在于克服当前β-葡聚糖合成酶活力测定技术中存在的一些问题，提供一种设备要求低、操作安全简便、灵敏度高、低成本的测定β-葡聚糖合成酶活力的试剂盒和应用。