[发明专利]一种β-葡聚糖合成酶活力的检测试剂盒、检测方法及应用

权利要求书

1.一种测定β-葡聚糖合成酶活力的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括β-葡聚糖合成酶酶解底物、外核苷三磷酸二磷酸水解酶ENTDP和测定UDP水解释放磷酸根含量的试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述外核苷三磷酸二磷酸水解酶ENTDP来源于细菌、丝状真菌或酵母。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述ENTDP的核苷酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.9所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6或SEQID NO.10所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述β-葡聚糖合成酶酶解底物为UDP-葡萄糖。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，所述测定UDP水解释放磷酸根含量的试剂包括采用钼酸铵-抗坏血酸分光光度法、磷钼酸-孔雀石绿分光光度法或离子色谱法所用的检测试剂。

6.权利要求1-5任一所述的试剂盒在测定β-葡聚糖合成酶活力中的应用或测定ENTDP水解UDP释放的磷酸根含量中的应用。

7.一种采用1-5任一所述的试剂盒测定β-葡聚糖合成酶活力的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将待测β-葡聚糖合成酶与所述酶解底物于温度25～40℃、pH 4.0～9.0条件下反应30min～48h；

(2)向步骤(1)的反应溶液中加入外核苷三磷酸二磷酸水解酶ENTDP，于温度25～50℃、pH 4.0～9.0、金属离子0.1～2.0μmol/mL条件下反应10min～2h；

(3)测定UDP水解释放磷酸根含量或消耗酶解底物的量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，添加的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的ENTDP时，于温度为35℃、pH 7.0、金属离子Zn²⁺0.5μmol/mL条件下反应；

添加的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的ENTDP时，于温度为40℃、pH 8.0、金属离子Ca²⁺1.0μmol/mL条件下反应；

添加的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的ENTDP时，于温度为30℃、pH 6.0、金属离子Zn²⁺0.7μmol/mL条件下反应。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述β-葡聚糖合成酶的酶活单位定义为：每微克β-葡聚糖合成酶蛋白单位时间内消耗的底物1nmol UDP-葡萄糖的量，或每微克β-葡聚糖合成酶蛋白单位时间内释放出的1nmol的磷酸盐的量。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述测定磷酸盐离子含量具体为采用钼酸铵-抗坏血酸分光光度法、磷钼酸-孔雀石绿分光光度法或离子色谱法测定ENTDP水解UDP释放的游离的磷酸盐离子含量。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述钼酸铵-抗坏血酸分光光度法具体为采用酸性条件磷酸盐与钼酸铵、酒石酸锑钾反应，生成磷钼杂多酸，再用抗坏血酸还原，在700nm处测定其吸光度，根据建立的标准曲线计算所释放的游离的磷酸盐离子含量。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述磷钼酸-孔雀石绿分光光度法具体为采用磷酸根与钼酸根在酸性条件下形成磷钼杂多酸缔合物，与孔雀石绿形成的弱键显色复合物，在620nm处测定其吸光度，根据建立的标准曲线计算所释放的游离的磷酸盐离子含量。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离子色谱法具体为采用阴离子色谱柱，采用强碱性溶液洗脱，电导检测器检测，根据保留时间定性，外标法定量测定所释放的游离的磷酸盐离子含量。