[发明专利]一种临床用自然杀伤细胞的制备方法

说明书

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，主要包括以下步骤：步骤一、从脐带血中分选CD34+标记的脐带血造血干细胞，并获得剩余单个核细胞；步骤二、剩余单个核细胞成份的优化；步骤三、NK细胞的培养和扩增；步骤四、细胞数量及细胞表型鉴定。本发明首先分离出脐带血中的自体血浆及单个核细胞，其次利用磁珠法分选出单个核细胞中以CD34+为表面标记的造血干细胞，获得造血干细胞的同时，也收获了除造血干细胞以外的剩余成份，用此剩余成份及自体血浆培养NK细胞，实现了资源的合理利用，使得同一份脐带血既可以进行造血干细胞回输，又可以培养出符合临床需求的具有抗肿瘤活性的NK细胞，适于广泛推广应用。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体为一种临床用自然杀伤细胞的制备方法。

背景技术

异基因造血干细胞移植是根治白血病的重要手段，但移植后白血病复发是困扰移植成功的评分障碍。移植后复发率可高达20%—80%，对于复发的患者治疗困难、预后差。二次移植虽可使部分患者再次缓解，但二次移植后相关合并症的发生率为25%—50%，极大地限制了二次移植的应用。近年来临床研究显示，取自原移植供体具免疫活性的淋巴细胞输注，可使异基因造血干细胞移植后白血病复发患者再次缓解，并且疗效好、毒性小。这种供者淋巴细胞输注可能成为新的预防异基因造血干细胞移植后白血病复发的策略。

供者淋巴细胞输注是指通过输入异基因造血干细胞移植术后供者的淋巴细胞来治疗恶性疾病的一种方法。其目标是通过移植物抗肿瘤效应来诱导和维持缓解。其中供者是指为患者提供异基因造血干细胞的人，因骨髓应用受限，目前多指为患者提供脐带血的人。而在实际应用中，寻找脐带血的供者比较繁琐且变数较多，因此有较多的局限性。供者淋巴细胞输注临床应用中供者的自然杀伤细胞（Natural Killer Cell , NK）是较为重要的淋巴细胞。NK细胞来源于骨髓，分布于外周血和脾脏，是一类固有免疫细胞，无需抗原预先致敏，且无主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex ,MHC）限制性，可直接杀伤肿瘤细胞或被感染的细胞，具有广谱的抗肿瘤作用，所以NK细胞在抗肿瘤免疫治疗中具有巨大的潜力。由于人体自身NK细胞的含量有限，在体外快速扩增获得大量活化的 NK 细胞是DLI临床应用的关键。

因此为解决现有脐带血造血干细胞移植后进一步进行供者NK细胞输注，而供者NK细胞来源获取局限性的问题，本发明提供了一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，可在体外大量培养进而获得符合临床需求的NK细胞。

发明内容

为解决现有脐带血造血干细胞移植后进一步进行供者NK细胞输注，而供者NK细胞来源获取局限性的问题，本发明提出一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，在分选出以CD34+为标记的脐带血造血干细胞后，进一步优化剩余的单个核细胞，可成功提取到符合临床需求的安全且高标准的NK细胞。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、从脐带血中分选CD34+标记的脐带血造血干细胞，并获得剩余单个核细胞

（1）健康供者的脐带血，转入离心管中充分混匀，吸取上层部分获得自体血浆，备用；

（2）将生理盐水与血细胞沉淀稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll层上，室温1800-2400rpm离心15-20min；

（3）吸出离心后的白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下800-1400rpm离心3-8min，重复两次；

（4）根据MACS CD34阳性免疫磁珠试剂盒说明书进行CD34+细胞的分选，获得以CD34+为标记的造血干细胞及剩余的单个核细胞成份；

步骤二、剩余单个核细胞成份的优化