[发明专利]一种临床用自然杀伤细胞的制备方法

权利要求书

1.一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、从脐带血中分选CD34+标记的脐带血造血干细胞，并获得剩余单个核细胞

（1）健康供者的脐带血，转入离心管中充分混匀，吸取上层部分获得自体血浆，备用；

（2）将生理盐水与血细胞沉淀稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll层上，室温1800-2400rpm离心15-20min；

（3）吸出离心后的白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下800-1400rpm离心3-8min，重复两次；

（4）利用MACS CD34阳性免疫磁珠试剂盒进行CD34+细胞的分选，获得以CD34+为标记的造血干细胞及剩余的单个核细胞成份；

步骤二、剩余单个核细胞成份的优化

（1）剩余的单个核细胞室温800-1400rpm离心3-8min，弃上清；

（2）用含2.5%人血清白蛋白、5%右旋糖苷的PBS缓冲液重悬，800-1400rpm离心3-8min，获得单个核细胞；

步骤三、NK细胞的培养和扩增

（1）自体血浆灭活

a、将步骤一获得的自体血浆加入8%的葡萄糖酸钙，52-58℃放置20-40min，灭活血浆中的补体；

b、2800-3400rpm离心1-5min，弃沉淀，将上清转移至新的离心管中待用；

（2）细胞培养

a、用PBS重悬滋养层细胞至50ml离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清；

b、将步骤一获得的单个核细胞及a中的滋养层细胞用含NK细胞完全培养基重悬，在175cm²培养瓶中混合，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

c、离心换液：将培养基吸出至50mL离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀；同时取离心后上清液进行需、厌氧菌和真菌、支原体检测；

d、每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量添加培养液，每次添加体积不宜超过现有体积一倍，加液时按5%的自体血浆加入NK细胞培养液；

e、计数，滋养层细胞用PBS重悬至50ml离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清，用NK培养基重悬后添加至培养瓶中；

f、当培养液体积大于300ml则转移至培养袋培养；

g、每天观察、计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加培养液，8天之后按1%添加自体血浆即可；

h、计数并收获NK细胞，取1ml细胞悬液进行流式检测，检测CD3-CD56+指标；

步骤四、细胞数量及细胞表型鉴定

（1）用细胞计数板进行细胞计数，计算细胞数和细胞活率；

（2）NK细胞表面标记物CD3-CD56+检测；

所述步骤三中的完全培养基为NK细胞无血清基础培养基再添加5%的自体血浆；

所述步骤e中，用NK培养基重悬后添加至培养瓶中，使细胞浓度在1.0×10⁶cell/ml以上；

所述步骤一中，脐带血转入离心管中充分混匀后，在室温下1800-2400rpm离心15-20min；

所述步骤一中，生理盐水与血细胞按1:1的比例进行稀释；

所述步骤二中，单个核细胞的细胞活率90%，细胞数量3×10⁷；

培养NK细胞的滋养层细胞为经辐照后的K562细胞。