[发明专利]一种蔗糖磷酸化酶的应用及利用其制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法

说明书

本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶的应用及利用其制备2‑α‑甘油葡萄糖苷的方法。所述蔗糖磷酸化酶为游离酶或固定化酶；固定化酶的制备方法为：通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到游离酶，用CS‑TPP@NF载体固定游离酶，得到固定化酶。以蔗糖、甘油为底物，在水或水溶液中进行催化反应，得到2‑α‑甘油葡萄糖苷。本发明中筛选出的蔗糖磷酸化酶催化活性高，在24 h内能够将蔗糖快速转化，转化率达到95%，2‑α‑甘油葡萄糖苷产量可达288.28 g/L。同时本发明的固定化酶副产物耐受性比游离酶高30%、可回收再利用，在水溶液中反应，降低生产成本，工艺简单，适合大规模工业化生产。

技术领域

本发明属于生物催化剂技术领域，特别涉及一种新型蔗糖磷酸化酶生物的应用及利用其催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法。

背景技术

蔗糖磷酸化酶转化法是将蔗糖磷酸化酶基因在大肠杆菌中克隆表达，以蔗糖和甘油为底物，建立的一种酶促合成2-α-甘油葡萄糖苷的方法。目前，利用这种方法生产2-α-甘油葡萄糖苷的最高产量仅为122 g/L，并且都存在转化时间长、酶活低、稳定性差、缓冲液成本高等问题。不仅如此，副产物的产生一直是制约酶催化效率提高的重要因素。在利用蔗糖磷酸化酶催化合成2-α-甘油葡萄糖苷的过程中会产生果糖副产物。果糖的不断积累会严重影响蔗糖磷酸化酶的催化效率以及2-α-甘油葡萄糖苷的产量。因此蔗糖磷酸化酶的果糖耐受性问题也是制约其应用的一个因素。

针对现有技术中的蔗糖磷酸化酶稳定性差、不能重复利用的缺陷，已有公开的技术方案采用固定化手段来改善。目前，现有的蔗糖磷酸化酶大都通过交联酶聚集体进行固定化，此固定化方法侧重于蔗糖磷酸化酶热稳定性和重复使用次数的提高，其他方面的改善并不明显。

因此，寻找一种酶活高的新型蔗糖磷酸化酶，并提高其稳定性、重复使用次数、果糖耐受性，在水溶液中催化合成2-α-甘油葡萄糖苷，具有极高的工业利用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种在水溶液中催化合成2-α-甘油葡萄糖苷的新型蔗糖磷酸化酶及其催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的具体方法，该酶酶活高、催化效率快，同时果糖耐受性强、稳定性好、可多次回收再利用，提高产量、降低生产成本。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种蔗糖磷酸化酶的应用，基因编码如序列1所述的蔗糖磷酸化酶在水或水溶液中催化蔗糖、甘油制备生成2-α-甘油葡萄糖苷。本发明通过与现存蔗糖磷酸化酶进行同源度比对，筛选出一种来自于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶（SPase），通过基因工程手段将所述基因导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶。

所述基因工程手段为：首先利用PCR对基因进行扩增，而后采用酶切连接手段将其导入表达载体质粒PET28a，通过大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。

本发明用于在水或水溶液中催化蔗糖、甘油制备生成2-α-甘油葡萄糖苷的酶可以是游离酶也可以是固定化酶，具体制备方法如下。

一种生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，所述方法包含以下步骤：1）通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶，将表达蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌细胞用高压匀浆法破碎，得到含有蔗糖磷酸化酶的粗酶液；2）利用步骤1）得到的粗酶液在水中催化蔗糖、甘油生成2-α-甘油葡萄糖苷。

进一步的，步骤1）中所述粗酶液中蔗糖磷酸化酶的浓度为1mg/mL~6 mg/mL。

进一步的，步骤2）的具体操作为：称量蔗糖、甘油溶解于去离子水中，形成混合溶液，加入粗酶液，使去离子水中蔗糖磷酸化酶的浓度为0.5~1.5mg/mL；摇床催化反应后，加热灭活酶；催化反应的温度为30℃~ 50℃，时间为24h~ 48h，pH值为6~8；蔗糖在去离子水中的浓度为0.3~1.5M、 甘油在去离子水中的浓度1.8~2.4M。