[发明专利]一种逆向跨多级神经示踪方法

权利要求书

1.一种逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，构建能够表达狂犬病病毒G蛋白的转基因动物，再用失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株感染转基因动物，利用转基因动物被感染的细胞为失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株提供G蛋白，恢复感染传播活性，实现逆向跨多级神经示踪目的。

2.根据权利要求1所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述转基因动物构建方法如下：构建含有外源G蛋白编码基因的打靶载体，通过同源重组的方式插入到实验动物胚胎干细胞的Rosa26位点两外显子之间，胚胎干细胞发育获得外源全身性表达G蛋白的转基因动物。

3.根据权利要求2所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述打靶载体为Rosa26-tdTomato-G-TVA-vector，基因组包括5’同源臂、启动子CAG、LSL表达盒、tdTomato序列、G蛋白编码基因序列、IRES序列、TVA序列、WPRE序列、PA序列、FRT序列、Neo抗性基因、3’同源臂、pGK启动子、DTA序列、polyA signal、CoLE1质粒复制起点、AmpR抗性基因、F1单链DNA复制起点。

4.根据权利要求3所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述打靶载体添加有酶切位点，包括SalⅠ、SmaⅠ、EcoRⅤ、XhoⅠ，其中，

SalⅠ分别添加在启动子CAG与LSL表达盒之间、tdTomato序列和G蛋白编码基因序列之间、WPRE序列和PA序列之间、Neo抗性基因和3’同源臂之间、3’同源臂和pGK启动子之间，AmpR抗性基因和F1单链DNA复制起点之间；

SmaⅠ分别添加在G蛋白编码基因序列和IRES序列之间、PA序列和FRT序列之间；

EcoRⅤ分别添加在TVA序列和WPRE序列之间、Neo抗性基因和3’同源臂之间、3’同源臂和pGK启动子之间；

XhoⅠ添加在polyA signal和CoLE1质粒复制起点之间。

5.根据权利要求2所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述插入外源G蛋白编码基因后的Rosa26位点所在基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求1-5所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述转基因动物为鼠、狗、或非人的灵长类动物。

7.根据权利要求6所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株为SAD-B19或CVS-N2C。