[发明专利]一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用

说明书

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用，涉及微生物分子生物学技术领域。所述组成型启动子包含如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的任一核苷酸序列。本发明能够提供19个金黄色葡萄球菌组成型启动子，且具有不同的表达活性，能够供基因不同水平的持续性表达。另一方面，本发明还提供了一种包含上述组成型启动子的表达载体，以实现目的基因在金葡菌中不同强度地持续性表达，进而为实现金葡菌耐药及毒力相关基因功能及调控机制的深度挖掘提供工具，并为新型抗菌药物的研发及临床抗感染治疗方案的制定提供新思路。

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学技术领域，尤其是涉及一种金黄色葡萄球菌组成型启动子、表达载体及其构建方法、重组菌株及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌是目前造成临床感染最常见的病原菌之一。随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus，MRSA)的出现和流行，世卫组织已将MRSA列入“重要等级”病原菌行列。MRSA之所以对人类的健康和生病造成严重威胁，主要是因为其严重的耐药性及复杂多变的免疫逃逸机制，使其在体内很难被彻底清楚，非常容易造成复发。因此，对金葡菌耐药及毒力相关基因功能及调控机制的深度挖掘，将为新型抗菌药物的研发及临床抗感染治疗方案的制订提供新的思路。

对金葡菌毒力基因及功能未知基因的研究采用的常规方法包括基因敲除、回补及过表达等。目前，金葡菌基因敲除、回补的基因工具及方法已被成功建立和广泛应用。但是，金葡菌基因过表达的基因工具却非常缺乏，这主要是因为缺乏可用的启动子。用于基因表达的启动子可分为两大类：诱导性启动子和组成型启动子。金葡菌中应用的诱导性启动子主要包括木糖诱导性启动子、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导性启动子及四环素诱导性启动子等。虽然这些启动子都能在金葡菌中有效的过表达基因，但是在应用的过程中具备一定的局限性，比如木糖型诱导启动子的活性通常会受葡萄糖的抑制，而葡萄糖是真核细胞中常见的物质，因此木糖型诱导启动子在金葡菌的动物及细胞感染模型中的应用受到限制。此外，所有诱导性启动子都需要诱导剂的诱导，而诱导剂的加入通常会影响金葡菌的正常生理代谢，甚至造成一些无法预期的表型出现。而组成型启动子不需要诱导剂的诱导便能让目标基因成功表达，是实现基因过表达的理想途径。

然而目前在金葡菌中用于基因持续性表达的组成型启动子非常少，主要有金葡菌转录调控因子SarA基因的启动子PsarA及编码荚膜基因启动子Pcap。组成型启动子的活性是固定的，因此用于基因表达时，基因的表达水平是固定的，如果想要不同水平地持续型表达基因，则需要不同强度的组成型启动子，以供基因不同水平的持续性表达。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种金黄色葡萄球菌组成型启动子，本申请提供的金黄色葡萄球菌组成型启动子具有不同的表达活性，可以供基因不同水平的持续性表达。

本发明的第二目的在于提供一种包含金黄色葡萄球菌组成型启动子的表达载体，以实现目的基因在金葡菌中不同强度地持续性表达，进而为实现金葡菌耐药及毒力相关基因功能及调控机制的深度挖掘提供工具。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种金黄色葡萄球菌组成型启动子，所述组成型启动子包含如SEQID NO.1至SEQ ID NO.19所示的任一核苷酸序列。

根据一种优选实施方式，具有如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列的所有组成型启动子具有不同的表达活性，且在金黄色葡萄球菌接种后的适应期、对数期和稳定期均能够高水平表达。

本发明还提供了一种包含上述金黄色葡萄球菌组成型启动子的表达载体。

根据一种优选实施方式，所述表达载体是在大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭载体质粒插入上述组成型启动子构建而成。

本发明还提供了一种所述的表达载体的构建方法，包括：