[发明专利]一种鉴定茯苓的特异性引物、试剂盒及鉴别方法

说明书

本发明提供了一种鉴定茯苓的特异性引物、试剂盒及鉴别方法，所述引物如下，正向引物：5′‑CTCCTCCCAAACGCATTAGC‑3′；反向引物：5′‑AATCTGTTTGTCCATCCGACC‑3′。本发明基于茯苓的ITS基因设计了多对引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了最佳的具有种属特异性的引物，使用上述引物对可实现目的基因的有效扩增，从而使茯苓能够得到快速准确鉴定。

技术领域

本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定茯苓的特异性引物、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。味甘、淡，性平，具有利水渗湿，健脾和胃，宁心安神的功效。现代研究表明，茯苓主要含有三萜类和多糖类两种化合物，具有利尿、抗炎和保肝等药理作用。作为中药八珍之一，茯苓在食品中的应用也很广泛。准确鉴定茯苓不仅保障了临床用药安全，对规范中药材市场，推动茯苓产业发展也具有重要意义。

市面上茯苓的伪品多由淀粉和植物粉末加工而成，运用理化手段较易区分饮片里是否有淀粉存在。而DNA条形码技术依赖样品自身的基因分子信息，可以用于鉴定样品是否为茯苓，但茯苓中多糖含量较高，特别是对于茯苓饮片和桂枝茯苓丸等含茯苓的常见中药来说，蒸制、晒干等加工过程会导致样品的DNA严重降解，不仅影响PCR扩增效率，而且扩增和测序的准确度也较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种鉴定茯苓的特异性引物、试剂盒或者方法，采用所述引物、试剂盒或者方法鉴定茯苓，鉴定结果准确可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测混合物中茯苓进行快速鉴定，效率高。

为此，本发明提供了一种用于鉴定茯苓的引物，所述引物如下：

正向引物：5′-CTCCTCCCAAACGCATTAGC-3′；

反向引物：5′-AATCTGTTTGTCCATCCGACC-3′。

本发明提供了一种鉴定茯苓的试剂盒，含有上述的引物。

进一步地，所述的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及无菌超纯水。

本发明还提供了一种所述的引物或所述的试剂盒在鉴定待测样品中茯苓成分的应用。

待测样品可以是新鲜茯苓、茯苓饮片、茯苓菌丝或者含有茯苓的中药。也可以是市面上茯苓的伪品，例如淀粉和植物粉末加工成的团块等。

其中本发明中，新鲜茯苓为未经炮制的茯苓，茯苓菌丝是由新鲜茯苓采用常规培养方法培养制得，培养方法可参见文献胡国元等，《茯苓菌丝体液体培养条件研究》，武汉工程大学学报，第32卷第7期。

含有茯苓的中药可以是茯苓配方颗粒、桂枝茯苓丸等常见中药。

本发明提供了一种鉴定茯苓的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的总DNA，备用；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：

正向引物：5′-CTCCTCCCAAACGCATTAGC-3′；

反向引物：5′-AATCTGTTTGTCCATCCGACC-3′；

(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有100～200bp的DNA片段，则所述待测样品存在茯苓；反之，则所述待测样品不存在茯苓。

本发明中，待测样品可以是新鲜茯苓、茯苓饮片、茯苓菌丝或者含有茯苓的中药。也可以是市面上茯苓的伪品，例如淀粉和植物粉末加工成的团块等。