[发明专利]一种鉴定茯苓的特异性引物、试剂盒及鉴别方法

权利要求书

1.一种鉴定茯苓的特异性引物，其特征在于，所述引物如下：

正向引物：5′-CTCCTCCCAAACGCATTAGC-3′；

反向引物：5′-AATCTGTTTGTCCATCCGACC-3′。

2.一种鉴定茯苓的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及无菌超纯水。

4.一种如权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定待测样品中茯苓成分的应用。

5.一种鉴定茯苓的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的总DNA，备用；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：

正向引物：5′-CTCCTCCCAAACGCATTAGC-3′；

反向引物：5′-AATCTGTTTGTCCATCCGACC-3′；

(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有100～200bp的DNA片段，则所述待测样品中存在茯苓；反之，则所述待测样品中不存在茯苓。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，提取步骤之前还包括对待测样品进行粉碎，然后取粉末与核分裂液混合，离心，取沉淀的步骤；

优选的，待测样品的质量与核分裂液的体积比为(40-150):(800-1200)；

优选的，核分裂液含有50-150mM的Tris-HCl、15-25mM的EDTA、0.5-0.8M的NaCl和1.5-3％PVP-40(W/V)。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR反应体系包括：

DNA模板，2～10.5μL；

正向引物，2.5μM，0.5～1.5μL；

反向引物，2.5μM，0.5～1.5μL；

2×Taq PCR MasterMix，10～15μL；

无菌超纯水补至25μL；

优选的，所述PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55～59℃退火30s，72℃延伸45s，进行35～40个循环；然后继续72℃延伸10min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序中，退火温度为57℃。

9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述100～200bp的DNA片段为172bp或131bp的DNA片段。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的172bp的DNA片段序列如SEQ IDNO.5所示；所述的131bp的DNA片段序列如SEQ ID NO.6所示。