[发明专利]马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白是由马链球菌马亚种的cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白依次以蛋白接头Gly-Gly-Gly连接后得到。

2.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，编码cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE 8种蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-10所示。

3.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白命名为SE8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.编码权利要求1-3任一项所述的重组融合蛋白的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

6.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求4或5所述的多核苷酸。

7.一种制备权利要求1所述的重组融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)目的基因的扩增

以马链球菌马亚种基因组为模板，分别以cneSEco(6p-1)F-cneSXho(6p-1)R、eagSEco(6p-1)F-eagSXho(6p-1)R、SclFsEco(6p-1)F-SclFsXho(6p-1)R、SclIsEco(6p-1)F-SclIsXho(6p-1)R、SclCsEco(6p-1)F-SclCsXho(6p-1)R、eq8sEco(6p-1)F-eq8sXho(6p-1)R、eq5sEco(6p-1)F-eq5sXho(6p-1)R、ideEsEco(6p-1)F-ideEXho R为引物，通过PCR扩增cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8、ideE基因；测序正确后，将目的基因与pGex-6p-1连接，转化至大肠杆菌DH5α，得到重组质粒分别命名为pGex-6p-1-cne，pGex-6p-1-eag，pGex-6p-1-SclC，pGex-6p-1-SclI，pGex-6p-1-SclF，pGex-6p-1-eq5，pGex-6p-1-eq8，pGex-6p-1-ideE；

引物的核苷酸序列如下：

cneSEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCactaatcttagtgacaacatcacatcattgac

cneSXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttacttgacagtaaagctggtatagcgac

eagSEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagacgcagcaacagtgttagag

eagSXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttatttggctttgttgattaaggtcacatag

SclFsEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCtcggaacccaatccatatccagatg

SclFsXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttaaggaccttgtttgccatttttaagttc

SclIsEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttatctggtccgccaggatacccac

SclIsXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttatggacctcgggtaccgcc

SclCsEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagaccagccagcagca

SclCsXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttatggcttttgggcagcttcttc

eq8sEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagcgactaccctagcaggacaaacag

eq8sXho(6p-1)R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttagtgcttaagcttttcaatctgagc

eq5sEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagaaacgactactgctagtgcatttg

eq5sXho(6p-1)R TCACGATGCGGCCGCTCGAGtagcaaccaaggctgccttggc

ideEsEco(6p-1)F CCCTGGGATCCCCGGAATTCttagacgattaccaaaggaatgctacgg

ideEXho R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGttagctcagtttctgccatatgtccttg

cne.eag1 taatccacctcccttgacagtaaagctggtatagcgac

cne.eag2 aagccaaataaCTCGAGCGGCCGCATC

cne.eag3 aagggaggtggattagacgcagcaacagtgttagag

cne.eag4 TCGAGttatttggctttgttgattaaggtcacatag

SclC.SclI1 taatccacctcctggcttttgggcagcttcttc

SclC.SclI2 gaggtccataaCTCGAGCGGCCGCATC

SclC.SclI3 ccaggaggtggattatctggtccgccaggatacc

SclC.SclI4 TCGAGttatggacctcgggtaccgcc

SclF.eq81 cgCtccacctccaggaccttgtttgccatttttaagttc

SclF.eq82 ttaagcactaaCTCGAGCGGCCGCATC

SclF.eq83 cctggaggtggagcgactaccctagcaggac

SclF.eq84 TCGAGttagtgcttaagcttttcaatctgagcC

eq5.ideE1 gtctccacctccAGtagcaaccaaggctgcc

eq5.ideE2 aactgagctaaCGAGCGGCCGCATCG

eq5.ideE3 aCTggaggtggagacgattaccaaaggaatgctacg

eq5.ideE4 GCTCGttagctcagtttctgccatatgtccttg

5eag.SclC1 gtctccacctcctttggctttgttgattaaggtcacatag

5eag.SclC2 gaggtccataaCTCGAGCGGCCGCATC

5eag.SclC3 aaaggaggtggagaccagccagcagcacTAAAATATC

5eag.SclC4 TCGAGttatggacctcgggtaccgcc

6eq8.eq51 ttctccacctccgtgcttaagcttttcaatctgagcC

6eq8.eq52 aactgagctaaCTCGAGCGGCCGCATC

6eq8.eq53 cacggaggtggagaaacgactactgctagtgcatttg

6eq8.eq54 TCGAGttagctcagtttctgccatatgtccttg

7SclI.SclF1 cgatccacctcctggacctcgggtaccgc

7SclI.SclF2 aactgagctaaCTCGAGCGGCCGCATC

7SclI.SclF3 ccaggaggtggatcggaacccaatccatatccag

7SclI.SclF4 TCGAGttagctcagtttctgccatatgtccttg

28a-8F TGGGATCCCCGGAATTCactaatcttagt

28a-8R TGCGGCCGCTCGAGttagctca

(2)重组载体的构建

通过同源重组将8个不同的S.equi基因片段cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE无缝连接，构建8个不同的S.equi基因的融合载体，具体方法如下：

用引物cne.eag1-cne.eag2、SclC.SclI1-SclC.SclI2、SclF.eq81-SclF.eq82和eq5.ideE1-eq5.ideE2分别对pGex-6p-1-cne、pGex-6p-1-SclC、pGex-6p-1-SclF和pGex-6p-1-eq5进行载体线性化，用引物cne.eag3-cne.eag4、SclC.SclI3-SclC.SclI4、SclF.eq83-SclF.eq84和eq5.ideE3-eq5.ideE4分别从pGex-6p-1-eag、pGex-6p-1-SclI、pGex-6p-1-eq5、pGex-6p-1-ideE扩增出包含同源片段的eag、SclI、eq5和ideE。分别将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应，构建pGex-6p-1-cne-eag、pGex-6p-1-SclC-SclI、pGex-6p-1-SclF-eq8和pGex-6p-1-eq5-ideE；用引物5eag.SclC1-5eag.SclC2和6eq8.eq51-6eq8.eq52分别对pGex-6p-1-cne-eag和pGex-6p-1-SclF-eq8进行载体线性化，用引物5eag.SclC3-5eag.SclC4和6eq8.eq53-6eq8.eq54从pGex-6p-1-SclC-SclI和pGex-6p-1-eq5-ideE分别扩增出含有同源片段的SclC-SclI和eq5-ideE；分别将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应，构建pGex-6p-1-cne-eag-SclC-SclI、pGex-6p-1-SclF-eq8-eq5-ideE；用引物7SclI.SclF1-7SclI.SclF2对pGex-6p-1-cne-eag-SclC-SclI进行载体线性化，引物7SclI.SclF3-7SclI.SclF4从pGex-6p-1-SclF-eq8-eq5-ideE扩增得到含有同源片段的SclF-eq8-eq5-ideE，将扩增得到的线性化载体和含有同源片段的基因片段进行重组反应，构建得到的载体命名为pGex-6p-1-SE8；

设计1对引物28a-8F/R，分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，以pGex-6p-1-SE8为模板扩增SE8片段，扩增产物用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接至EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-28a载体，构建得到的载体命名为pET-28a-SE8；

(3)重组蛋白的表达及纯化

将重组质粒pET-28a-SE8转入BL21(DE3)中，阳性菌落接种到含有1％卡那霉素的LB培养基中，37℃150r/min培养2.5h，加终浓度为0.5mM IPTG于16℃诱导表达24h。离心收集菌体，破碎菌体取上清，利用亲和柱层析法对表达蛋白进行纯化。