[发明专利]从包含高度裂解细胞的发酵液中回收蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种从细菌发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，其中所述发酵液中的细菌细胞表现为高度裂解，所述方法包括以下步骤：以0.5至50g/L所述发酵液的量向包含所述感兴趣的蛋白的发酵液中添加至少一种絮凝剂；通过过滤，优选通过终端过滤或者微孔过滤将所述感兴趣的蛋白与至少所述细菌细胞分离；和从而在滤液中获得所述感兴趣的蛋白；其中所述细菌细胞是芽胞杆菌细胞。此外，本发明涉及絮凝剂在从包含高度裂解的细胞的细菌发酵液中回收感兴趣的蛋白中的用途。

本发明涉及一种从细菌发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，其中所述发酵液中的细菌细胞表现为高度裂解，所述方法包括以0.5至50g/L所述发酵液的量向包含所述感兴趣的蛋白的发酵液中添加至少一种絮凝剂；其中所述细菌细胞为芽胞杆菌细胞；通过过滤，优选通过终端过滤或者错流微孔过滤将所述的感兴趣的蛋白与至少所述细菌细胞分离，和从而在滤液中获得所述感兴趣的蛋白。

在感兴趣的工业蛋白(例如酶)的合成步骤，发酵步骤中可以实现高滴度的感兴趣的蛋白，并且这也是所期望的。菌株和发酵方法的最新进展导致发酵液中细胞密度的增加，这也导致进一步增加感兴趣的蛋白的滴度。然而，因为会发生不需要的细胞裂解，所以高细胞密度可能是有问题的。特别是在发酵结束时，培养基会含有大量裂解的细胞。此外，在回收感兴趣的蛋白的后续操作之前的发酵液储存中(例如，在固液分离和下游程序之前)，可能会发生不需要的细胞裂解。细胞裂解可能是因为不平衡增长和/或发酵罐中的环境条件，如剪切力、不良的物质(mass)和氧传递、有毒废物积累、来自蛋白过度表达的代谢压力以及来自蛋白在周质空间中积累或储存的内部压力。细胞裂解通常导致细胞内内容物(如DNA和蛋白质，包括潜在的感兴趣的蛋白)释放到发酵液中。不受控的细胞裂解对下游操作提出了巨大的挑战，所述操作包括澄清/固液分离和进一步的下游处理。已知由此产生的细胞碎片和在发酵液中存在的胞外DNA会妨碍下游操作，如澄清发酵液和固液分离，包括过滤及离心。然而，为保证高的总体产品收率和产品质量，当前的回收和纯化步骤必须在发酵结束后一定的时间窗口内实施。因此，需要高效且简单的手段，为从包含高度裂解细胞的发酵液中回收感兴趣的蛋白提供时间灵活性。

US 2005/0176090 A1公开了一种从真菌发酵液中纯化感兴趣的胞外产物的方法，包括对发酵液进行絮凝，涉及费力的破碎/破坏过程，未提及有高度裂解细胞的细菌发酵液。

WO2014/118220A1公开了在大肠杆菌细胞发酵液中使用絮凝剂实现高效颗粒尺寸分布，以实现高效澄清的方法。该方法应避免为确定在澄清处理的各阶段中絮凝剂的有效剂量而做耗时的检测，其中所述澄清是通过离心法实现的。

US 2003/129707 A1公开了一种从发酵液产生蛋白悬浮液的方法，该方法是用一种或者多种促凝剂和/或者一种或者多种絮凝剂处理培养基，并通过分离(特别是通过使用离心旋转式滗析器(decanter of a cyclone)机)将生物质与所述蛋白分离。US2016/297850A1涉及一种利用阳离子聚合物、非离子聚合物和非离子表面活性剂从哺乳动物细胞培养液中回收重组蛋白的方法。

US 2011/184154 A1公开了一种用于通过使培养液与微粒状阴离子交换剂接触澄清细胞培养液，特别是哺乳动物细胞培养液的方法，所述培养液具有高密度的分泌所期望的生物学物质的细胞，所述生物学物质具有总体正电荷。

EP 1930419 A1描述了一种使用阳离子表面活性剂从高密度微生物发酵液中回收酶的程序。

然而，现有技术没有提供从表现出细胞高度裂解的细菌发酵液中回收感兴趣的蛋白的高效并且简单的手段。

在本发明中相关的技术问题可以视为提供符合上述需求的手段和方法。它可以通过权利要求中的和本文以下所描述的实施方案来解决。

本发明涉及一种从细菌发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，其中所述发酵液中的细菌细胞表现为高度裂解，所述方法包括以下步骤：

a)以0.5至50g/L所述发酵液的量向包含所述感兴趣的蛋白的发酵液中添加至少一种絮凝剂；