[发明专利]用于RNA合成的组合物和方法

说明书

本文提供了用于合成RNA产物的组合物和方法。例如，本公开提供了一种产生RNA产物的方法，所述方法包括孵育体外转录混合物，从而产生包含多种单链RNA分子的RNA产物。在一些实施方案中，体外转录混合物包含DNA模板，其包含可操作地连接至靶序列的RNA聚合酶启动子序列；至少一种RNA聚合酶，其识别所述RNA聚合酶启动子序列；多种核糖核苷酸，其包括至少两种不同类型的核糖核苷酸，每种类型包含不同的核苷；以及转录缓冲液，其包含渗透剂。

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月1日提交的美国临时申请号63/019,158的权益，其内容特此整体并入文中。

背景技术

RNA疗法，包括mRNA疗法，在临床环境中已为人所知。因此，需要开发和/或合成安全和有效的RNA疗法的方法。

发明内容

本公开提供了用于高收率体外转录的组合物和方法。本公开特别提供了以下见解：一种或多种渗透剂可以用作促进在高温下使用RNA聚合酶(例如，野生型噬菌体RNA聚合酶)进行的体外转录(例如，体外RNA转录)的手段，所述RNA聚合酶在不存在渗透剂的情况下在这种高温下不能正常发挥作用。本公开还提供了以下见解：本文所述的技术(例如，在高温下(例如，在这种温度下，野生型RNA聚合酶在不存在这样的一种或多种渗透剂的情况下不能正常发挥作用)在存在一种或多种渗透剂(例如，本文所述的渗透剂)的情况下，用野生型RNA聚合酶进行RNA转录)可以产生具有降低的免疫原性和/或细胞毒性的RNA。这些性质可以增加例如RNA产物的治疗效力。

在一些实施方案中，本文所述的技术可以对mRNA的产生特别有用，因为合成RNA产物的更高纯度可以实现编码蛋白质的更高效率翻译。因此，在一些实施方案中，本文所述的技术可以用于产生RNA产物，在一些实施方案中，所述RNA产物可以是或包括mRNA。RNA产物的实例包括例如抑制性RNA、反义寡核苷酸、基因疗法和疫苗。

本公开特别提供了一种产生RNA产物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括孵育体外转录混合物，从而产生包含多种单链RNA分子的RNA产物的步骤。在一些实施方案中，体外转录混合物包含DNA模板、至少一种RNA聚合酶、多种核糖核苷酸和转录缓冲液，所述DNA模板包含可操作地连接至靶序列的RNA聚合酶启动子序列，所述RNA聚合酶识别RNA聚合酶启动子序列，所述核糖核苷酸包括至少两种不同类型的核糖核苷酸，每种类型包含不同核苷，所述转录缓冲液包含渗透剂。

在一些实施方案中，渗透剂是或包括基于氨基酸的渗透剂、甲胺渗透剂、碳水化合物渗透剂或它们的组合。

在一些实施方案中，甲胺渗透剂是或包括甘油磷酰胆碱三甲胺N-氧化物或它们的组合。

在一些实施方案中，碳水化合物渗透剂是或包括山梨糖醇、甘油、肌醇、磷酸二甘油或它们的组合。

在一些实施方案中，基于氨基酸的渗透剂是或包括基于脯氨酸的渗透剂、基于甘氨酸的渗透剂、基于依克多因(ectoine)的渗透剂、基于丙氨酸的渗透剂或它们的组合。

在一些实施方案中，基于丙氨酸的渗透剂是或包括β-丙氨酸。在一些实施方案中，基于氨基酸的渗透剂是或包括基于甘氨酸的渗透剂。在一些实施方案中，基于甘氨酸的渗透剂是或包括甜菜碱。

在一些实施方案中，甜菜碱以至少0.25M、至少0.5M、至少0.75M、至少1M、至少1.5M、至少2M或至少2.5M的浓度存在于所述体外转录混合物中。在一些实施方案中，甜菜碱以至多15M、至多10M、至少5M或至少2.5M的浓度存在于所述体外转录混合物中。在一些实施方案中，甜菜碱以约0.5M至约10M、或约2M至约5M的浓度存在于所述体外转录混合物中。