[发明专利]用于表征低丰度宿主细胞蛋白的方法

说明书

本申请提供了用于鉴定含有高丰度蛋白的样品中的宿主细胞蛋白(HCP)杂质的方法和系统。可以使用已与固相载体连接的相互作用肽配体来富集所述HCP杂质。可以使用含有相转移表面活性剂的溶液来从所述固相载体洗脱所述HCP杂质。可以消化所分离HCP杂质以产生所述所分离HCP杂质的组分，随后可以使用质谱仪来鉴定所述组分。

技术领域

本发明通常涉及用于鉴定和定量低丰度宿主细胞蛋白(HCP)以监测和控制生物制药产品中的杂质的方法和系统。

背景技术

重组DNA技术已经广泛用于在宿主细胞中产生生物制药产品。生物制药产品必须达到非常高的纯度标准。因此，在药物开发、生产、储存和处理的不同阶段监测此类生物制药产品中的任何杂质可能都是重要的。在进行临床研究之前，残余杂质应处于可接受的低水平。例如，宿主细胞蛋白(HCP)可以存在于使用基于细胞的系统开发的基于蛋白质的生物制药中。药物产品中HCP的存在需要被监测，并且在超过一定量时可能是不可接受的。有时，即使微量的HCP也会引起免疫原性应答。

免疫测定已用于使用多克隆抗HCP抗体监测HCP去除。免疫测定可以以高通量提供总HCP水平的半定量，但其可能不能有效的快速定量单独的HCP。最近出现了用于监测HCP去除的液相色谱法-质谱法(LC-MS)。然而，在存在高浓度的经纯化的抗体的情况下，HCP的巨大动态浓度范围对于开发LC-MS方法来监测HCP的去除可能是一个挑战。

应当理解，存在对鉴定和定量HCP以监测和控制原料药中残余的HCP以减轻安全风险的方法和系统的需求。

发明内容

由于非常高的样品复杂性，生物制药产品中HCP杂质的鉴定遇到了处理广泛动态范围的蛋白质浓度的挑战。本申请提供了鉴定包含满足富集治疗药物产品中低丰度HCP的需要的富集方法的含有高丰度蛋白的样品中的HCP杂质的方法和系统。

本公开提供了一种鉴定样品中的HCP杂质和/或对样品中的HCP杂质进行定量的方法。在一个示例性实施例中，鉴定样品中的HCP杂质和/或对样品中的HCP杂质进行定量的所述方法包括：使所述样品与固相载体接触，其中相互作用肽配体已与所述固相载体连接，并且所述HCP杂质可以与所述相互作用肽配体结合；使用包括表面活性剂的溶液洗涤所述固相载体来分离HCP杂质并且提供洗脱液；使所述洗脱液经受酶消化反应以产生所述所分离HCP杂质的组分；并且使用质谱仪鉴定所述所分离HCP杂质的所述组分；其中所述样品包括至少一种高丰度肽或蛋白。一方面，本申请的所述方法中的所述表面活性剂是相转移表面活性剂、离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或其组合。另一方面，本申请的所述方法中的所述表面活性剂是脱氧胆酸钠、月桂基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠。

一方面，本申请的所述方法中的所述至少一种高丰度肽或蛋白的浓度为每种HCP杂质的浓度的约至少1000倍、约10,000倍、约100,000倍或约1,000,000倍。一方面，本申请的所述方法中的所述相互作用肽配体是组合六肽配体的文库。另一方面，本申请的所述方法中的所述HCP杂质是使用所述质谱仪来定量的，其中每种HCP杂质的检测限为约0.05ppm到0.1ppm。另一方面，本申请的所述方法中的所述至少一种高丰度肽或蛋白是抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白、蛋白质药物产品或药物。一方面，本申请的所述方法中的所述酶消化反应的酶是胰蛋白酶。

又另一方面，本申请的所述方法中的所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中所述质谱仪耦接到液相色谱法系统。一方面，所述质谱仪能够执行LC-MS(液相色谱法-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱法-多反应监测-质谱法)分析。