[发明专利]可溶性重组蛋白的生产

说明书

本发明涉及用于在微生物中表达和纯化产物诸如肽和蛋白的方法和组合物。具体而言，重组表达前产物，其中微生物的细胞质改变表达的前产物以产生活性/最终或其他期望形式的产物。与期望重组产物的表达相关的改变包括改变细胞质的氧化还原状态以允许适当的蛋白折叠、前蛋白的定点切割以活化蛋白、从蛋白的N末端定点切割不需要的甲硫氨酸和/或一种或多种连接以形成期望的蛋白构型，所有都在相同细胞内。

本发明中的权利

本发明是在美国政府支持下完成的，资助号为1R43AI148018-01A1 FAIN:R43AI148018，由美国国立卫生研究院授予，并且美国政府在本发明中具有一些权利。

对相关申请的引用

本申请要求2021年2月24日提交的美国临时申请号63/152,954；2020年3月16日提交的美国临时申请号62/990,083；和2020年3月16日提交的美国申请号16/819,775的优先权，且所述申请目前在审，其各自的全部内容具体通过引用并入。

发明领域

本发明涉及在微生物中表达和纯化产物、诸如肽和蛋白的方法和组合物。具体而言，重组表达前产物，其中微生物的细胞质改变表达的前产物以产生最终或可用形式的产物。改变包括细胞质的氧化还原状态的转变和定点切割和/或连接。

背景描述

大肠杆菌是一种广泛使用的宿主，以产生用于研究和治疗目的的重组蛋白。重组蛋白可以在大肠杆菌细胞质或周质中表达。在大肠杆菌中细胞质重组蛋白表达的一个限制是，为了起始重组蛋白在大肠杆菌中的表达，蛋白的编码序列应该以ATG密码子开始，所述密码子被翻译成甲酰甲硫氨酸，且然后由甲酰甲硫氨酸脱甲酰酶加工以成为N-末端甲硫氨酸。因此，对于大肠杆菌中的重组蛋白表达，将ATG密码子添加至天然或成熟的蛋白序列。在重组蛋白的细胞内表达期间，N-末端甲硫氨酸通常被内源性大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶(MAP)切除。该过程对重组蛋白不一定有效，即使相邻的残基最适合用于切割，这可能是由于重组蛋白的过表达和存在有限量的MAP。作为结果，大量的重组蛋白可能具有甲硫氨酸作为第一个氨基酸。这对大多数蛋白来说是不期望的，因为N-末端甲硫氨酸不是成熟蛋白序列的一部分。N-末端甲硫氨酸的存在也可能引起影响其功能的蛋白的结构变化。确保N-末端甲硫氨酸的有效切割的现有方法包括用重组MAP进行体外处理。另一种方法是将MAP编码序列添加至表达载体，且因此与重组蛋白共表达MAP。在后一种情况下，MAP的共表达可能降低期望重组蛋白的表达。两种方法实施起来既费时又费钱。因此，期望具有一种大肠杆菌表达菌株，其中MAP高度表达而不显著抑制重组蛋白表达。这将允许在细胞质中产生增加量的具有其天然序列的靶蛋白。

在大肠杆菌的细胞质中表达的重组蛋白可能形成不溶性内含体。内含体中的蛋白可以在体外重新折叠以形成可溶性蛋白。这些蛋白将含有N-末端甲硫氨酸，这是不期望的。

大肠杆菌细胞质具有还原环境，并且含有二硫键的重组蛋白在细胞内表达时通常是不溶的。相反，大肠杆菌的周质具有氧化环境。因此，许多含有二硫键的重组蛋白被分泌至周质中，以确保适当的折叠和溶解度。引导重组蛋白进入周质的信号肽在分泌过程期间被剪掉，导致产生具有天然氨基酸序列的蛋白。然而，将蛋白引导至周质的易位机制能力有限，且因此重组蛋白的周质表达水平通常较低。另一方面，在大肠杆菌细胞质中的表达可导致每升细胞培养物中数克的重组蛋白。因此，期望能够在细胞质中表达可溶的、正确折叠的二硫键键合的蛋白。此外，如果可以在没有N-末端甲硫氨酸的情况下产生这些蛋白，那将是期望的。

市售的大肠杆菌菌株，诸如Origami^® (EMDMillipore)、Shuffle^® (New EnglandBio)(具有gor-/trx-突变)，可以产生含有二硫键的可溶性细胞内蛋白，但这些细胞菌株是有缺陷的，并且不能生长至高密度，限制了产量。因此，尽管这些菌株适合生成研究材料，但它们的低生长水平使它们难以商业化使用。因此，存在对表达高水平正确折叠的不含N-末端甲硫氨酸的细胞内二硫键键合蛋白的菌株的需求。

发明概述