[发明专利]可溶性重组蛋白的生产

权利要求书

1.产生含有一个或多个硫键的蛋白的方法，其包括：

从含有基因组和编码蛋白序列的表达载体的重组细胞表达蛋白，其中所述重组细胞的一种或多种二硫键还原酶的活性降低，且所述蛋白的N-末端含有甲硫氨酸；

从所述重组细胞的基因表达肽酶，其中所述肽酶从表达的蛋白的N-末端除去甲硫氨酸；和

分离所述蛋白。

2.权利要求1的方法，其中表达的蛋白包括破伤风毒素、破伤风毒素重链蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素、假单胞菌外蛋白A、铜绿假单胞菌类毒素、百日咳博德特氏菌类毒素、产气荚膜梭菌类毒素、大肠杆菌(E. coli)不耐热毒素B亚基、脑膜炎奈瑟氏菌外膜复合物、流感嗜血杆菌蛋白D、鞭毛蛋白Fli C、鲎血蓝蛋白、或其片段、衍生物或修饰物。

3.权利要求1的方法，其中所述重组细胞的仅一种二硫键还原酶的活性降低。

4.权利要求1的方法，其中多于一种二硫键还原酶的活性降低。

5.权利要求1的方法，其中所述重组细胞是大肠杆菌细胞或大肠杆菌的衍生物或菌株。

6.权利要求5的方法，其中所述重组细胞从ATCC保藏号PTA-126975获得或衍生。

7.权利要求1的方法，其中所述肽酶包括甲硫氨酸氨肽酶。

8.权利要求1的方法，其中所述表达载体含有核糖体结合位点、起始密码子和/或表达增强子区。

9.权利要求1的方法，其中所述表达载体含有诱导型第一启动子且表达所述蛋白包括用第一诱导剂诱导所述诱导型第一启动子。

10.权利要求1的方法，其中所述基因含有诱导型第二启动子且表达所述肽酶包括用第二诱导剂诱导所述诱导型第二启动子。

11.权利要求1的方法，其中所述表达载体含有诱导型第一启动子且表达所述蛋白包括用第一诱导剂诱导所述诱导型第一启动子，所述基因含有诱导型第二启动子且表达所述肽酶包括用第二诱导剂诱导所述诱导型第二启动子，且所述第一诱导剂和所述第二诱导剂是相同的。

12.权利要求1的方法，其中所述肽酶基因被整合至所述重组细胞的基因组中。

13.权利要求1的方法，其中分离包括色谱法。

14.权利要求12的方法，其中所述色谱法包括硫酸盐树脂、凝胶树脂、活性硫酸化树脂、磷酸盐树脂、肝素树脂或肝素样树脂。

15.权利要求1的方法，其进一步包括将所述分离的蛋白与化学化合物缀合或偶联。

16.权利要求14的方法，其中所述化学化合物包括多糖、聚合物、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、肽、抗体或抗体的一部分、脂质、脂肪酸或其组合。

17.产生肽的方法，其包括：

在含有编码肽酶的基因的重组细胞中表达所述肽，

其中编码所述肽酶的基因被整合至所述重组细胞的基因组中，

其中所述重组细胞的一种或多种二硫键还原酶的活性降低，

其中一种或多种二硫键还原酶的活性降低导致细胞质的氧化还原状态转变为与一种或多种二硫键还原酶的活性没有降低的重组细胞相比更高的氧化状态，且

其中所述肽含有N-末端甲硫氨酸；

表达从所述肽除去N-末端甲硫氨酸的肽酶；和

分离所述肽。