[发明专利]用于RT-LAMP反应的扩增体系组合物、RNA病毒的RT-LAMP方法及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及用于RT‑LAMP反应的扩增体系组合物、RNA病毒的RT‑LAMP方法及应用。本发明提供的逆转录酶M‑MLV可以在60℃～65℃条件下依旧保持稳定的逆转录效率，将其用于RNA病毒的RT‑LAMP，与60℃～65℃条件下可恒温高效扩增的Bst酶搭配使用，即可实现在60℃～65℃条件下，仅用一步完成对RNA的高效扩增，解决现有技术中操作繁琐的技术问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及用于RT-LAMP反应的扩增体系组合物、RNA病毒的RT-LAMP方法及应用。

背景技术

目前在病原检测领域，基于聚合酶链式反应基因扩增的检测方法(如定量逆转录PCR、逆转录PCR)是病毒检测的标准确认方法，尽管以PCR为核心基础的技术已经被分子诊断委员会和政府有关部门认为是病毒检测的金标准，但是这些方法需要专业训练的人员以及昂贵的仪器设备，因此在资源有限的地方(例如不发达地区、不发达的产业如养殖业等)得不到广泛的应用。基因PCR为基础的方法需要耗时且复杂的方案，这极大的限制了在各种疾病发病率迅速呈指数增涨的大流行情况下的诊断效力，尤其是在全球广泛流行的病毒如SARS-COV-2。因此，需要建立一种简单又可靠的方法进行分子诊断。

LAMP(One step loop-mediated isothermal amplification)环介导等温扩增反应能够在等温的条件下(60度到65度)，在特别的引物设计情况下能够检测到目标核酸序列，甚至在极地的核酸存在的情况下，也可以进行检测。由于该方法操作简单，因此它在各种病毒性疾病的诊断中越来越受欢迎。在RNA病毒的检测过程中，需要一种额外的逆转录酶(M-MLV)，因此该方法叫做逆转录LAMP(RT-LAMP)，与RT-PCR不同，该方法可以在单个任意大小的PCR管中在低资源的环境中进行反应，因此在即时诊断(Point of care testing，PoCT)的场景中，RT-LAMP与RT-PCR相比具有明显的优势。同时已有报道，RT-LAMP的诊断成本也明显的低于RT-PCR。因此越来越多的研发人员投入到针对RT-LAMP的研发和优化工作中，使RT-LAMP在不同的场景中能够广泛的应用。

目前现有的RT-LAMP还是需要两个步骤：第一步，首先在恒温下进行逆转录，最佳常用温度为37℃，然后是进行LAMP反应，最佳的温度为60℃，由于存在不同的温度，因此在实验的过程中，增加了设备的投入，增加了成本。并且由于过程比较繁琐，增大了操作的难度，未经过专业训练的人员操作时，检测的成功率下降。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于，将一种热稳定性高的逆转录酶应用于RT-LAMP中，使得逆转录步骤和LAMP扩增步骤均可在同一较高温度下进行，从而实现一步法进行RT-LAMP反应，显著降低操作难度，从而实现作业人员的快速扩充，以能够应对更加紧急的卫生安全事件，具有极高的社会意义和经济价值。

本发明的另一个目的在于，提供采用上述热稳定性高的逆转录酶进行RT-LAMP的方法，在不需要调整温度的基础上，希望提供种“一步法”即可实现有效扩增的方法，降低对设备的要求，进一步促进推广应用。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV在RNA病毒RT-LAMP反应中的应用。

在可选的实施方式中，所述RNA病毒包括SARS-COV-2病毒。

第二方面，本发明提供用于RT-LAMP反应的扩增体系组合物，所述扩增体系组合物中的逆转录酶为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV。

在可选的实施方式中，所述扩增体系组合物还包括DNA聚合酶、dNTP、保护剂和引物组。