[发明专利]高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用，所述贝莱斯芽孢杆菌突变株以贝莱斯芽孢杆菌HCK2为出发菌株，利用同源重组原理，敲除或者失活贝莱斯芽孢杆菌HCK2基因组中负调控RapF、SerA基因所得。本发明构建的单基因敲除突变株ΔSerA、ΔRapF和双基因突变株ΔRapF+SerA在发酵条件下用于高效生产表面活性素产量，其中RapF+SerA突变株在优化的培养基和发酵条件下用于生产表面活性素产量是贝莱斯芽孢杆菌HCK2的5倍，在5L发酵罐40‑50h可稳定生产表面活性素约16.5g/L。该表面活性素高产基因突变株及其构建方法为加速表面活性素的产业化提供原材料。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一类高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用。

背景技术

表面活性素是由枯草芽孢杆菌和相关物种产生的一种环状脂肪七肽内酯，它包含两个酸性氨基酸(Glu和Asp)，旁边有五个非极性残基和一个3-羟基脂肪酸。由于其出色的表面活性和抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原生质的活性，它具有广泛的生物技术和治疗应用。然而，野生的芽孢杆菌菌株的表面活性素产量通常为每升几十毫克，很少超过每升1克。这使得表面活性素的生产非常昂贵，从而限制了表面活性素进入实际应用。通过物理化学诱变和野生的芽孢杆菌菌株的发酵优化来提高表面活性素的生产，已经得到了广泛和深入的研究。最近，基于表面活性素的生物合成途径和分子调控机制的基因工程方法来提高芽孢杆菌的表面活性素产量得到了极大的关注。

表面活性素不仅具有抗菌活性，而且作为一种信号分子参与到芽孢杆菌菌株的多细胞行为中，包括蜂群运动、细胞分化和生物膜形成。因此，Surfactin的生物合成与其他生物活性分子一样受到非常严格的监管。srfA的表达受一个依赖细胞密度的双组分法定量感应系统ComP-ComA控制。在生长后期，膜激酶ComP能够感知累积的典范寡肽ComX进入激活状态，通过磷酸化(ComA～P)刺激转录因子ComA的活性。最终，ComA～P以四聚体形式与srfA操作子的启动子(PsrfA)结合，并与sigA合作，激活srfA基因的转录表达。另一个调节途径是由phrC编码的典范寡肽CSF介导的。CSF由寡肽渗透酶在细胞内运输，并与Rap蛋白结合，导致其去磷酸化的酶活性丧失，从而维持ComA的磷酸化水平，促进srfA基因转录和表面活性素的合成。除了正向调节器ComA和sigA，srfA操作子的表达也通过几个负向调节器进行调节。全局调节器CodY和AbrB可以通过直接结合到srfA启动子区域来抑制srfA的转录。调节器SpX通过阻断comA和RNA聚合酶之间的相互作用来抑制srfA的表达。PerR、sinI和PhoP等负调控因子也参与了抑制srfA表达的详细报道。此外，自我抵抗基因SwrC(yerP的同义词)编码强大的表面活性素出口器，对于表面活性素的高产量也是必不可少的。有趣的是，只有一小部分处于对数生长后期的细胞可以分化为生产表面活性剂的细胞，而感应到表面活性素信号的外围细胞会关闭表面活性素的合成途径，分化为合格细胞、细胞外基质生产者等。然而，人们对表面活性素的自我反馈抑制性信号通路知之甚少。总的来说，随着对表面活性素的分子调控、自身免疫和反馈抑制机制的逐步深入，将大大有助于我们通过合理的设计方法提高表面活性素的产量。