[发明专利]高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用

权利要求书

1.高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)突变株，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌突变株以贝莱斯芽孢杆菌HCK2出发菌株，保藏号CCTCC NO:M2019396，敲除或者失活菌株基因组中基因RapF和/或SerA所得。

2.权利要求1所述的高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以RapF和SerA基因核酸序列设计引物，以贝莱斯芽孢杆菌HCK2的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到 RapF和SerA基因片段；

（2）对PCR扩增产物和质粒进行双酶切，得到酶切基因片段和线性质粒片段，经酶连得到重组质粒pUCSCRapF和pMUTIN4SerA；所述质粒为pUCSC和pMUTIN4；

（3）将重组质粒pUCSCRapF和pMUTIN4SerA同时或者分别转入贝莱斯芽孢杆菌HCK2中，构建得到三种突变菌株贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF、贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔSerA、贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA。

3.根据权利要求2的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述的引物为：

RapFF： 5′-TTT AAGCTT GTCAAAGATTGTATCGAGAA-3′

RapFR： 5′-TTT GGATCC TTTCATACAACTTCACACCT-3

SerAF ：5′-TTT AAGCTT CTCAGATAAGATGAGCAATG-3′

SerAR ：5′-TTT GGATCCTTCCACTTCAAACACGTCAA-3′。

4.根据权利要求2的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述的酶为Hind III和BamH I。

5.权利要求1所述高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株在生产表面活性素中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌突变株进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7 .0，温度维持在35-37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0 .1-5g/ L；发酵周期40-50h。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖10-15g/L，谷氨酸5-8g/L，K₂HPO₄ 1-3g/L，KH₂PO₄ 1-3g/L，KCl 1g/L，MnSO₄•7H₂O 500mg/L，FeSO₄•7H₂O5mg/L，CuSO₄•5H₂O 160mg/L，其余为水，pH 7.0。