[发明专利]一种应用于原代肿瘤细胞的靶基因编辑方法

说明书

本申请涉及一种原代肿瘤细胞基因编辑方法，其包括：将包装有Cas9蛋白编码序列及sgRNA编码序列的慢病毒加入到包含原代肿瘤细胞的液体基质中；将所述慢病毒与所述原代肿瘤细胞共同培养；其中将所述慢病毒加入到包含原代肿瘤细胞的液体基质中时，所述原代肿瘤细胞为非贴壁状态。

技术领域

本申请涉及基因编辑技术，更具体的涉及一种高效的在原代肿瘤细胞中使用CRISPR-Cas9技术对靶标核酸序列进行编辑的方法。

背景技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，有规律的聚簇间隔短回文重复序列)与Cas9核酸酶(CRISPR-Cas9)技术，已经可以成功地在干细胞等多种类型细胞中产生基因敲除和核苷酸序列的改变。近来，CRISPR-Cas9技术也被成功地用于在体内编辑小鼠原代细胞的基因组。但是，在体外培养的原代肿瘤细胞中用CRISPR-Cas9方法进行基因编辑成功率很低。一部分原因是原代肿瘤细胞数量少，体外培养增殖困难，增殖速度慢，另一部分原因是原代肿瘤细胞转染效率低，外源组分难以导入细胞等。此外，原代肿瘤细胞在体外培养的周期较短，需要在短时间内完成基因编辑，也增加了在体外培养的原代肿瘤细胞中进行基因编辑的难度。常规CRISPR- Cas9方法编辑过的细胞需要经过多次传代和增殖，经历苛刻的筛选条件，时间周期长，也不适用于原代肿瘤细胞编辑。例如：有文章报道采用CRISPR- Cas9方法在人原代气道呼吸上皮细胞中敲除MUC18基因，需要进行长达39 天的嘌呤霉素筛选。(Hong Wei Chu et al.CRISPR-Cas9 mediated geneknockout in primary human airway epithelial cells reveals a pro-inflammatoryrole for MUC18.Gene Ther.2015,22(10):822–829.)在原代人结肠癌细胞中过表达 P53突变体蛋白和OCT4蛋白，需要进行嘌呤霉素药物筛选和两周左右的单克隆挑选。(Koshkin,S.,Danilova,A.,Raskin,G.et al.Primary cultures of human colon cancer as amodel to study cancer stem cells.Tumor Biol.37,12833–12842 (2016).Mondal etal.Δ133p53α,a natural p53 isoform,contributes to conditional reprogrammingand long-term proliferation of primary epithelial cells.Cell Death andDisease.2018,9:750)

发明内容

为了解决现有技术中原代肿瘤细胞基因编辑周期长，效率低等问题，本申请目的在于提供一种快速、高效和稳定的原代肿瘤细胞基因编辑方法。因此，本申请具体涉及：

1.一种原代肿瘤细胞基因编辑方法，其包括：

将包装有Cas9蛋白编码序列及sgRNA编码序列的慢病毒加入到包含原代肿瘤细胞的液体基质中；

将所述慢病毒与所述原代肿瘤细胞共同培养；

其中将所述慢病毒加入到包含原代肿瘤细胞的液体基质中时，所述原代肿瘤细胞为非贴壁状态。

2.根据项1所述的方法，其还包括：

在将所述慢病毒加入到包含原代肿瘤细胞的液体基质中之前，

利用饲养层细胞对原代肿瘤细胞进行扩增培养。

3.根据项2所述的方法，其中，

利用饲养层细胞对原代肿瘤细胞进行扩增培养之后，去除饲养层细胞以控制所述饲养层细胞占饲养层细胞和原代肿瘤细胞总数的比例在5％以下，优选在4％以下，进一步优选在3％以下，进一步优选在2％以下，进一步优选在1％以下。