[发明专利]基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法及应用

说明书

本发明公开了基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法及其应用。Bcl6‑SE敲除的动物模型的构建方法包括如下步骤：1)靶向小鼠Bcl6‑SE序列的gRNA设计：2)将步骤1)中的一对gRNA进行纯化并和cas9质粒共同注射小鼠胚胎，获得F0代小鼠；3)鉴定Bcl6‑SE基因型，筛选出阳性F0代小鼠；4)阳性F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠自交获得纯合后代，从而构建得到Bcl6‑SE基因敲除的动物模型。本发明基于CRISPR/Cas9技术实现对Bcl6‑SE调控序列的定点敲除，具有操作简单，敲除效率高的优势。

技术领域

本发明属于生物工程的实验动物模型技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法及应用。

背景技术

Bcl6(B cell lymphoma 6)基因编码一个含有保守锌指结构的转录抑制因子，属于BTB/POZ转录因子家族。Bcl6通过募集特异性染色质修饰辅抑制复合体来抑制许多靶基因表达。Bcl6最初作为原癌基因被鉴定，在体液免疫和淋巴瘤发生中发挥关键作用。Bcl6可以介导弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞异常增殖、基因组不稳定和分化阻滞。生发中心(Germinal Center)是B细胞产生高亲和力抗体的地方，而Bcl6是生发中心的关键调节因子。Bcl6在B细胞早期发育中也发挥作用，可以对抗免疫球蛋白轻链V(D)J重组中诱发的凋亡。

超级增强子(super enhancers，SEs)是一种由连续排列的调控元件串联形成的超长增强子，可以强力驱动细胞相关基因的表达，细胞中的数百个SEs控制着关键基因，决定细胞命运走向。在肿瘤发生、老年痴呆、糖尿病及许多自身免疫疾病中，均发现致病基因的表达与部分超级增强子的异常活化高度相关。研究表明Bcl6附近存在超级增强子(Bcl6-super enhancer，Bcl6-SE)，并且该增强子对Bcl6具有一定的调剂作用，从而参与T细胞的发育调控。然而，Bcl6-SE究竟是如何调控Bcl6基因的表达，从而影响T细胞发育的过程仍不是很清楚，因此构建超级增强子Bcl6-SE敲出小鼠显得尤为重要。

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及其相关Cas9蛋白介导的新一代基因编辑技术具有操作容易、成本低廉的优势，可实现精确高效的基因编辑功能，包括定点插入、定点敲除及定点突变等，已广泛用于多种动植物的基因编辑。介于CRISPR/Cas9进行基因编辑的优势，本专利采用该技术对Bcl6-SE进行基因编辑，构建超级增强子敲出小鼠模型。

发明内容

本发明旨在提供一种基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法及其应用。

针对上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法，包括如下步骤：

1)靶向C57小鼠Bcl6-SE序列的gRNA设计：

根据Bcl6-SE序列设计一对相应的gRNA，其中，gRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；

2)mRNA制备并显微注射获得F0小鼠：

将步骤1)中的一对gRNA进行纯化并和cas9质粒共同注射小鼠胚胎，获得F0代小鼠；

3)鉴定Bcl6-SE基因型，筛选出阳性F0代小鼠；

4)阳性F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠自交获得纯合后代，从而构建得到Bcl6-SE敲除的动物模型。