[发明专利]KPC型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用

说明书

本发明公开了KPC型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用。本发明具体地公开了包括特异性扩增KPC型碳青霉烯酶基因的引物对和crRNA的组合物，含有该组合物的试剂盒以及利用该组合物进行核酸检测的方法。本发明采用PCR技术联合CRISPR‑Cas13a技术检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的靶向该序列的特异性crRNA，本发明提供的方法简便、快速、具有较高的灵敏度和特异性。可用于临床快速鉴定产碳青霉烯酶菌株，从而对患者进行合理的抗生素治疗，以缩短治疗周期。有着非常重要的临床应用前景和开发价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及KPC型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用。

背景技术

碳青霉烯类抗菌药物是一类广谱β-内酰胺类抗菌药物，因其抗菌谱广、抗菌作用强，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一，被认为是20世纪80年代以来治疗耐多药革兰阴性杆菌感染的最后一道防线。近年来随着临床上广谱抗菌药物的不当和过度使用等不合理用药情况的增多，导致了对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率也随之加速上升。目前对碳青霉烯类抗菌药物产生耐药的主要菌群是肠杆菌科细菌，其耐药产生的主要机制为产生了一种可水解碳青霉烯类抗菌药物的水解酶，即碳青霉烯酶(Carbapenemase)。根据Ambler分类方法可将其分为三类(A、B和D类)，A类酶包括KPC、GES、SME等，B类酶包括NDM、IMP、VIM等，D类酶包括OXA-48等。虽然种类较多，但在全球范围内主要流行以下5种碳青霉烯酶：KPC(Klebsiella Pneumoniae Car-bapenemase，KPC)、NDM(New Delhi Metallo-β-Lactamases，NDM)、VIM(Verona integron-encoded Metallo-β-Lactamases，VIM)、IMP(Imipenem-resistant Pseudomonas)、OXA-48(Oxacillin-hydrolysing carbapenemase)。KPC型碳青霉烯酶是我国较为流行的一种碳青霉烯酶，其次为NDM型碳青霉烯酶。

目前实验室常用的碳青霉烯酶表型检测方法包括：改良Hodge试验、针对B组碳青霉烯酶的亚胺培南EDTA双纸片协同试验、CLSI推荐的Carba-NP确证试验以及碳青霉烯失活法(CIM)试验，但以上检测方法不仅无法得知具体的碳青霉烯酶基因型，并且检测过程需要耗时24-96h。常用的碳青霉烯酶基因型检测方法包括：传统的PCR法、荧光定量PCR法、全基因组测序等，但这些检测方法需要依赖大型仪器设备，导致其检测成本十分高昂，严重限制其使用和推广。

近年来，基因编辑技术发展迅速，不同亚型的CRISPR-Cas的基因编辑系统拓展了临床检测、基础研究和生物医学领域方面的应用。CRISPR-Cas系统分为两大类，Cas13a是第二大类VI型系统中的效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性，它能够特异性靶向切割单链RNA，并在切割后仍保持活性，继续切割其他非靶标RNA，这种特性被称为“附带切割”。利用Cas13a的这种附带切割活性，将其运用于分子诊断检测中，通过在检测体系内加入含有报告基团的单链RNA探针，当Cas13a识别到靶序列的存在时，就会转入一种酶促“激活”状态，进而切割单链RNA探针释放荧光报告基团，发出荧光信号，实现检测靶标序列的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何精准、灵敏、简便、快速地检测KPC型碳青霉烯酶基因。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的组合物，所述组合物包括特异性扩增KPC型碳青霉烯酶基因的引物对和crRNA，所述crRNA的序列由用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向KPC型碳青霉烯酶基因靶点序列的向导序列组成，所述向导序列可为SEQ ID No.1。