[发明专利]通过特异性敲除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程

说明书

本发明涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明涉及一种通过特异性敲除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程的方法。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明涉及一种通过特异性敲除或敲低Tyk2促进心肌细胞重编程的方法。

发明背景

全世界2300万人患有心力衰竭，通常由心肌细胞损伤或心肌细胞功能障碍引起。心肌细胞丢失的一个常见原因是导致心肌梗死的缺血性心脏病，由于心脏再生能力有限，损伤是永久性和渐进性的。尽管在医学治疗方面取得了进展，但目前除了原位心脏移植外，还没有恢复肌肉质量的策略，而原位心脏移植受限于细胞来源数量和长期疗效。迄今为止，在人体试验中使用的细胞疗法已经证明移植的细胞不会大量变成心肌细胞，也不会在心脏中持续存在。多能干细胞来源的心肌细胞移植正在接受测试，如果在细胞存活、成熟和电生理整合等问题得到有效解决后，这可能是有价值的。利用细胞类型特异的转录因子(TF)将细胞原位重编程为在疾病中丢失的细胞类型，是一种很有希望的除细胞治疗以外的另一有效的组织再生方法。在心脏中，大量的非心肌细胞，主要是心脏成纤维细胞，可以通过转录因子转变为诱导的心肌细胞样细胞。

自第一代通过3种心脏特异性TF：GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)的心肌细胞重编程成功问世以来，已经有很多关于增强心脏重编程效率的报道。通过改变GMT三个基因的计量学，在GMT基础上鉴定额外的基因，或者通过操纵信号通路，体外产生的心肌细胞样细胞的质量和效率都可以得到改善。在大多数情况下，效率的提高主要是在小鼠胚胎成纤维细胞中发现的；相反，对心脏成纤维细胞以及成体皮肤为起始的重编程却效果有限。尽管最近siRNA介导的bmi1基因敲除，以及通过SB431542联合XAV939的策略提高了体外心脏成纤维细胞重编程的效率，但仍有待于确定是否存在能进一步增强小鼠重编程或影响人心脏成纤维细胞重编程的方法。

因此，本领域仍然需要新的重编程方法，其能够通过重编程高效地产生功能性心肌细胞，从而治疗心脏疾病例如心力衰竭。

附图简述

图1.小分子化合物SB43152(C1)和Baricitinib(C2)的组合(2C)可以显著提高转录因子组合GMT(Gata4、Mef2c和Tbx5)介导的心肌细胞重编程效率，并且可在Gata4不存在下实现高效心肌细胞重编程。

图2.测试敲低Tyk2对心肌细胞重编程的影响的示意图。A：实验设计图，以新生鼠成纤维细胞为起始细胞，在感染转录因子MT组合和shRNA的情况下，仅在重编程培养基(加入C1)的条件下重编程为心肌细胞。B：重编程具体实验步骤。C：Tyk2的敲低效果。

图3.示出在MT+SB的情况下，通过敲低Tyk2从成纤维细胞诱导出大量心脏特异性标志物cTnI和a-actinin阳性细胞。

图4.示出qPCR检测重编程的细胞心脏特异性标志物的表达水平。

图5.示出通过CRISPR敲除Tyk2可以促进转录因子MT以及小分子化合物C1诱导的心肌细胞重编程。

发明详述

本发明人发现通过敲低或敲除Tyk2可以促进转录因子和小分子化合物诱导的心肌细胞重编程。

因此，在一方面，本发明提供一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括特异性敲低或敲除起始细胞中Tyk2的表达。

如本文所用，所述“敲低或敲除”指的是使内源Tyk2的转录水平或翻译水平上的表达消除或降低，或者指导致内源Tyk2蛋白中的突变而造成其活性的消除或降低。

本领域已知多种敲除或敲低基因表达的方法，这些都可以应用于本发明。在一些实施方案中，通过向所述起始细胞导入特异性靶向Tyk2的shRNA、反义RNA或siRNA来敲低Tyk2的表达。