[发明专利]改进的心肌细胞重编程方法

说明书

本发明涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明涉及一种改进的心肌细胞重编程方法。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明涉及一种改进的心肌细胞重编程方法。

背景技术

全世界2300万人患有心力衰竭，通常由心肌细胞损伤或心肌细胞功能障碍引起。心肌细胞丢失的一个常见原因是导致心肌梗死的缺血性心脏病，由于心脏再生能力有限，损伤是永久性和渐进性的。尽管在医学治疗方面取得了进展，但目前除了原位心脏移植外，还没有恢复肌肉质量的策略，而原位心脏移植受限于细胞来源数量和长期疗效。迄今为止，在人体试验中使用的细胞疗法已经证明移植的细胞不会大量变成心肌细胞，也不会在心脏中持续存在。多能干细胞来源的心肌细胞移植正在接受测试，如果在细胞存活、成熟和电生理整合等问题得到有效解决后，这可能是有价值的。利用细胞类型特异的转录因子(TF)将细胞原位重编程为在疾病中丢失的细胞类型，是一种很有希望的除细胞治疗以外的另一有效的组织再生方法。在心脏中，大量的非心肌细胞，主要是心脏成纤维细胞，可以通过转录因子转变为诱导的心肌细胞样细胞。

自第一代通过3种心脏特异性TF：GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)的心肌细胞重编程成功问世以来，已经有很多关于增强心脏重编程效率的报道。然而，所能获得的效率仍然较低。因此，本领域仍然需要新的重编程方法，其能够通过重编程高效地产生功能性心肌细胞，从而治疗心脏疾病例如心力衰竭。

附图说明

图1：分离MICF和筛选候选转录因子的策略的示意图。

图2：由ACF和NCF诱导的iCM的免疫荧光表征。报道的组合“GMT”能够从新生和成年心脏成纤维细胞诱导大量的Cherry+表达cTnI的iCMs。比例尺：100μm。

图3：A：由GMT加上其他因子诱导的mCherry+细胞第14天的定量数据(n＝3)。B：Myocd或Sall4可以增加Myh6-mCherry阳性细胞的数量。诱导后两周拍照。

图4：示出GMT加Myocd和Sall4诱导后，FACS分析Myh6-mCherry表达(n＝4)的结果。GMT加Myocd和Sall4诱导后，mCherry+细胞的百分比显著增加。

图5：示出GMTMS+1策略诱导的mCherry+细胞第28天的定量数据(n＝3)。

图6：示出GMTMS-1策略诱导的细胞的统计和形态学分析结果。

图7：使用GMTMS从成肌纤维细胞生成的心肌样细胞的免疫荧光表征。(左)大量GMTMS诱导的iCM共表达cTnT和cTnI。在用GMT、GMTM、GMTS、GMTMS(GATA4、MEF2C、TBX5、Sall4、MYOCD)和GMTMM(GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1、MYOCD) 转导MICF(来自8周龄的C57小鼠)后3周，对cTnT(红色)和cTnI(绿色)进行了免疫荧光。(右)cTnT和cTnI双阳性细胞定量。来自三个独立测定的数据，表示为平均值±SD， n＝3。比例尺：100μm.

图8：从成年心脏成纤维细胞诱导的心肌样细胞的免疫荧光表征。(左)在使用GMT、GMTM、GMTS、GMTMS和GMTMM转导ACF(来自C57小鼠，8周大)后3周进行了 cTnT(红色)和cTnI(绿色)的免疫荧光检测。注，ACF能够通过四个转录因子进行重新编程生成大量的iCM。(右)cTnT和cTnI双阳性细胞的定量。来自三个独立实验的数据表示为平均值±SD，n＝3。比例尺：100μm。

图9:示出与MICF相比，GMTMS诱导的心肌细胞中心脏基因的mRNA表达高度上调。诱导4周后进行定量PCR。

图10:示出与MICF相比，GMTMS诱导的心肌细胞中成纤维细胞基因的mRNA表达下调。诱导后4周进行定量PCR。