[发明专利]一种动物源活病毒定量检测方法

说明书

本发明公开了一种动物源活病毒定量检测方法，属于生物技术领域，该方法包括：a.待测病毒液样品采用叠氮溴化乙锭进行处理；b.采用等电点沉淀法进一步处理后，取上清液备用；c.取上清液，提取病毒核酸；d.采用实时荧光定量PCR进行病毒核酸PCR检测，根据扩增曲线Ct值，计算得到待测病毒液样品中活病毒含量；本发明的动物源活病毒荧光定量PCR检测方法，具有敏感性高、特异性强、准确度高、检测周期短等优点，解决了现有检测方法的不足，满足兽医生物制品生产中病毒含量的检测的需要。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种动物源活病毒定量检测方法。

背景技术

在动物源病毒试验研究和生物制品生产中，常需要对病毒含量进行定量检测，常用的检测方法包括鸡胚半数感染量法、细胞半数感染量法、动物半数感染量法、病毒蚀斑法、间接免疫荧光法和血凝试验法等方法，但以上方法普遍存在影响因素多，精确度不高等问题。

实时荧光定量PCR技术已经应用于细菌、病毒等微生物定量检测中，敏感性强，特异性好。但由于病毒存在的环境理化值、温度等因素变化，常有部分病毒囊膜蛋白变性或核衣壳破裂发生，从而使病毒丧失感染性，基于荧光定量PCR方法不能有效区分病毒是否有感染性，即难以区分活病毒和失活病毒，检测结果不准确。

叠氮溴化乙锭是一种对核酸有高度亲和能力的光敏反应材料，能够进入破裂的细胞或细菌体内，与DNA/RNA结合形成共价键，抑制其发生PCR扩增反应，叠氮溴化乙锭已经应用于多种食源性致病菌的活菌检测，现有研究表明细菌失活后，菌体迅速破裂暴露出核酸，应用叠氮溴化乙锭处理后，能够消除失活菌核酸对PCR检测结果的影响，实现对活菌定量检测。

近年来叠氮溴化乙锭应用于病毒的检测开始有相关研究，然而该技术应用还存在一些问题。病毒失活后，较长时间内存在无感染性的病毒颗粒，核酸被核衣壳蛋白、囊膜蛋白等包裹，叠氮溴化乙锭不能与这些未暴露的核酸结合，上述失活病毒核酸会影响PCR检测的准确性，因此需要一种能区分活病毒与失活病毒的实时荧光定量PCR检测方法，实现对动物源活病毒定量检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物源活病毒定量检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法能区分出活病毒与失活病毒，实现对动物源活病毒的定量检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种动物源活病毒定量检测方法，所述方法包括以下步骤：

a.待测病毒液样品采用叠氮溴化乙锭进行处理；

b.采用等电点沉淀法进一步处理后，取上清液备用；

c.取上清液，提取病毒核酸；

d.采用实时荧光定量PCR进行病毒核酸PCR检测，根据扩增曲线Ct值，计算得到待测病毒液样品中活病毒含量。

本发明检测方法，将添加叠氮溴化乙锭、等电点沉淀技术和实时荧光定量PCR技术相结合，先采用叠氮溴化乙锭去除暴露的病毒核酸，再采用等电点沉淀去除未暴露核酸的失活病毒，从而使待测病毒液中失活病毒和活病毒得以区分，使得失活病毒核酸不会干扰荧光实时定量PCR检测，至此，本发明建立了一种新型快速的动物源活病毒定量检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强、准确度高、检测周期短等优点，达到快速准确定量活病毒的目的，为兽医生物制品生产中病毒含量的检测提供技术支持。

进一步地，所述待测病毒液为动物源病毒液。

进一步地，所述待测病毒液样品采用叠氮溴化乙锭进行处理，具体包括：在待测病毒液样品中加入叠氮溴化乙锭溶液，避光混匀，采用强光照射处理。

进一步地，在待测病毒液样品中加入叠氮溴化乙锭溶液，使所述叠氮溴化乙锭在待测病毒液中的终浓度为50～100μmol/mL。