[发明专利]蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用。蟋蟀CDA1和CDA2基因的获取：通过巢式PCR获得目的基因，将目的基因与T载体连接，转入感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑取白斑到LB液体培养基中，进行菌液PCR，有目的条带的菌液送测序。蟋蟀CDA1和CDA2基因合成的dsRNA以及在害虫防治中的应用：设计带有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR扩增，切胶回收获得合双链RNA的模板，体外转录合成dsRNA，蟋蟀注射dsRNA后，出现死亡，大量延迟发育表型，其卵的孵化率也明显降低的现象。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用。

背景技术

dsRNA在生物体内普遍存在，自然环境中易于降解，具有物种专一性、无毒、无害、残留时间短等显著优点。因此RNA干扰是绿色环保的抗病虫技术，对作物病虫害防控展现了巨大的应用前景。RNAi抗虫技术是一种新型绿色无公害的害虫防治方法，它以害虫生长发育或重要行为过程中特异性的关键基因为靶标，利用人工合成的双链RNA沉默这些基因的表达，通过影响害虫的发育和繁殖，降低虫口密度，达到害虫防控的效果。RNAi抗虫技术中的关键是获得目标昆虫关键基因，并据此制备关键基因的双链RNA。

昆虫浆膜表皮是胚胎在卵期的重要保护层之一，昆虫在卵期处于相对静止的状态，需要依靠发育过程中所生成的各种保护层保护其免受外界压力的胁迫。昆虫浆膜包裹胚胎并分泌浆膜表皮，浆膜表皮具有维持卵的正常发育并且可以进行气体、水分或部分无机物的内外交换，并具有抵抗强氧化剂，抵抗干燥等功能。因此，本发明利用RNAi技术影响浆膜表皮对卵的保护，从而在卵期降低蟋蟀的密度，对于害虫防治具有重要的现实意义。

昆虫几丁质去乙酰基酶基因1(CDA1)和几丁质去乙酰基酶基因2(CDA2)本身基因存在较大区别。表现在：1、序列不同，二者蛋白质相似性为63％，核酸相似性为76％；2、作用时间不同，CDA1在蟋蟀发育早期起作用，而CDA2主要在蟋蟀胚胎发育晚期起作用。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种蟋蟀CDA1和CDA2基因的获得方法、dsRNA的合成方法及其在害虫防治中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种蟋蟀CDA1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种蟋蟀CDA2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述蟋蟀CDA1和CDA2基因的获得方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：利用clone manager各设计两对引物如下：

蟋蟀CDA1基因：第一对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示，第二对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQID NO.8所示；

蟋蟀CDA2基因：第一对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，第二对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQID NO.12所示；

(2)模板制备：参照TaKaRa Trizol试剂盒提取总RNA，然后反转录成cDNA，从而得到PCR扩增所需模板；

(3)PCR扩增：通过巢式PCR扩增获得目的基因，将目的基因与T载体连接，转入感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑取白斑到LB液体培养基中，进行菌液PCR，有目的条带的菌液送测序，测序结果正确的菌株保存于-80℃。

所述蟋蟀CDA1和CDA2基因片段合成的dsRNA。