[发明专利]一种小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法

说明书

本发明公开了一种小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法。本发明的小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法包括：从小鼠肾皮质组织中提取肾小球；小鼠肾小球壁层上皮细胞的原代培养、传代以及传代后的维持培养。本发明采用细胞筛联合磁性分离的方法可成功分离提取肾小球，培养原代PECs；经鉴定，本发明培养的原代PECs表达PECs特异性标志蛋白claudin‑1，未表达足细胞标志物nephrin，近端小管标志物aquaporin‑1和系膜细胞蛋白α‑SMA。本发明体外培养的PECs传至6代后仍表达标志蛋白，具有分化潜能，为进一步深入研究PECs的生物学特性及与肾小球疾病的关系提供了基础。

技术领域

本发明涉及一种小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

肾小球壁层上皮细胞(PECs)是位于肾小球包曼氏囊的扁平细胞，在生理条件下发挥了选择性的渗透屏障作用。最近的研究发现PECs可能直接参与某些肾小球疾病如新月体肾小球肾炎(CGN)和局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的发病；此外，PECs可能是肾小球内祖细胞，参与了足细胞损伤后的再生修复。因此，PECs在肾小球疾病中的作用越来越受到人们的重视。

目前已有的原代肾小球的提取方法包括：

1、连续过筛法：Ohse等依次使用180μm(80目)、107μm(150目)和75μm(200目)细胞筛分离获取小鼠肾小球[1]。单纯使用细胞筛的分离方法需要结合人工挑选肾小球或接种培养后挑选贴壁肾小球爬出细胞并进行后续挑选单克隆的方式才能获得单一种类的细胞，步骤繁琐，效率低下。

2、免疫磁珠法：Ronconi等使用CD133、CD24免疫磁珠筛选分离CD133+CD24⁺PECs[2]。这一方法需要酶消化，对肾组织进行解离形成单细胞悬液，并且需要其他免疫磁珠如CD31免疫磁珠和CD45免疫磁珠先行进行负选去除内皮细胞和白细胞。免疫磁珠分离虽然能够获得纯度非常高的单一细胞悬液，然而其费用比较昂贵，步骤繁琐。

3、微磁珠法：Kabgani等报道先使用直径4.5μm的微磁珠(Dynabeads M450)灌注小鼠，使微磁珠嵌顿于小鼠肾小球毛细血管袢，然后使用100μm细胞筛对切碎的肾皮质进行初步组织解离，最后通过磁力架吸附磁珠将肾小球从悬液中分离出来[3]，本法虽然步骤较为简单，但费用昂贵。

尽管体内研究(包括动物模型实验)仍然是研究肾小球疾病的“金标准”，但是体内研究能够深入地进行PECs机制研究的条件有限，特别是细胞生物应答过程中的胞内机制研究通常需要体外培养具有与体内细胞特性基本一致的细胞进行体外实验。相比较针对足细胞、系膜细胞和小管上皮细胞而言，目前可靠稳定的PECs细胞培养模型屈指可数。Shakland等用慢病毒转染SV40大T抗原进入小鼠PECs基因组使其永生化，是目前用于研究PECs的细胞系。然而永生化的细胞系经历基因组改造，其生理功能和对刺激的反应与体内均有一定程度的不同。体外原代培养的细胞状态是可以获得的与体内性状最接近的细胞，也便于控制相关条件进行深入分子机制研究的较好的工具。因此，建立体外原代PECs培养体系并维持其在一定代数内的稳定具有重要意义。

参考文献：

[1]Ohse T,Pippin JW,Vaughan MR,et al.Establishment of conditionallyimmortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture[J].J AmSoc Nephrol,2008,19(10):1879-1890.DOI:10.1681/ASN.2007101087