[发明专利]一种小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法

权利要求书

1.一种小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将小鼠肾皮质组织切成碎块，用预冷无菌D-HBSS湿润切碎的肾皮质组织，过80目细胞筛，收集组织悬液，组织悬液过150目细胞筛，再次收集组织悬液于离心管中，离心，收集细胞组织；

步骤2：加入D-PBS重悬步骤1.1所得的细胞组织于无菌离心管中，将离心管置于磁力架，静置离心管，吸出离心管内组织悬液并收集，用D-PBS冲洗吸附于离心管壁上的组织，吸净D-PBS后换新鲜D-1×PBS冲洗，重复冲洗3次；

步骤3：吸净D-1×PBS后，用上皮细胞生长培养液重悬组织，此时组织悬液内主要为肾小球，即得小鼠肾小球悬液；

步骤4：将小鼠肾小球悬液均匀铺于I型胶原包被的培养皿，于CO₂细胞培养箱中进行原代培养，期间观察肾小球贴壁和细胞爬出情况，吸去未贴壁组织，更换培养基；

步骤5：采用预热至37℃的1×PBS冲洗培养皿；

步骤6：吸净1×PBS，加入预热至37℃的0.25％的胰酶消化，加入胰酶孵育，期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态，当贴壁细胞变小变圆边缘透亮时立刻加入预热至37℃的完全培养液终止消化，用移液器轻轻吹打培养皿底上的细胞，将细胞全部冲下，得到细胞培养液；

步骤7：将细胞培养液通过40μm细胞筛，目的是去除肾小球，收集细胞培养液于离心管中，进行离心；

步骤8：离心后弃去上清培养液，用手指轻弹离心管底以弹松细胞沉淀，加入上皮细胞生长培养液重悬细胞后均匀铺于培养皿中，于CO₂细胞培养箱中进行培养；

步骤9：当细胞长至90％～100％汇合后，进行传代培养。

2.如权利要求1所述的小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，其特征在于，所述步骤1中碎块的大小为0.1×0.1×0.1mm，所述离心的条件为：500～600×g离心5～6min。

3.如权利要求1所述的小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，其特征在于，所述步骤4中原代培养的条件为：37℃、5％CO₂的条件下培养7天。

4.如权利要求1所述的小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，其特征在于，所述步骤6中孵育的条件为：37℃下孵育3～5min。

5.如权利要求1所述的小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，其特征在于，所述步骤7中离心的条件为：500～600×g离心3～4min。

6.如权利要求1所述的小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，其特征在于，所述步骤8中培养的条件为：37℃、5％CO₂的条件下培养，每2～3天更换一次上皮细胞生长培养液。

7.如权利要求1所述的小鼠肾小球壁层上皮细胞的提取和培养方法，其特征在于，所述步骤9中的传代培养中，当细胞传代至3代以后采用普通含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液进行维持培养。