[发明专利]鉴别地中海贫血αααanti4.2杂合型和HKαα杂合型的方法和试剂盒

说明书

本发明提供了鉴别地中海贫血αααanti4.2杂合型和HKαα杂合型的方法和试剂盒，通过设计对HBA2和HBA1基因扩增效率一致的特异性引物，并与特异性检测X1/X2融合片段的引物组混合，对待测样本进行扩增，通过两轮多重PCR，能够快速准确鉴别αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型。该方法检测操作简便快捷，通量高成本低，很好地弥补现有技术缺点。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体的，涉及一种鉴别地中海贫血αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型的方法和试剂盒。

背景技术

地中海贫血(简称地贫)是一种常见的溶血性单基因遗传病。该病是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，致使血红蛋白的组成成分比例失衡，进而导致血红蛋白不稳定，红细胞容易破裂从而引发溶血性贫血。根据缺陷的珠蛋白基因不同，地贫有多种类型，主要类型为α地中海贫血(简称α地贫)和β地中海贫血(简称β地贫)。珠蛋白基因在染色体上以基因簇的形式存在，α珠蛋白基因簇定位于16号染色体16p13.3，α地贫主要由α-珠蛋白基因(HBA1、HBA2基因)缺失引起，少数由α-珠蛋白基因突变引起。β珠蛋白基因簇定位于11号染色体11p15.3，β地贫主要由β-珠蛋白基因(HBB基因)突变引起，包括点突变及微小插入/缺失，少数的β地贫由β-珠蛋白基因簇上的大片段缺失引起。

在我国常见的α地贫缺失类型主要有-α3.7、-α4.2、--SEA等，它们主要是α珠蛋白基因簇同源序列不等交换的结果。α珠蛋白基因簇上两个高度同源的重复单元中包含X、Y和Z同源区，同源Z区重组交换致使一条染色体缺失3.7kb，另一条染色体则形成α珠蛋白基因αααanti3.7三联体。同源X区重组交换致使一条染色体缺失4.2kb，另一条染色体则形成α珠蛋白基因αααanti4.2三联体。β-地贫分为重型、轻型和中间型3种，其中，当β-地贫杂合子合并α珠蛋白基因三联体时，可加剧珠蛋白失衡的情况，使患者由无临床症状转变为中间型地贫。

在αααanti3.7和αααanti4.2基础上进一步发生非平衡交叉可能产生多种复杂基因重复序列。HKαα是由-α3.7型缺失和αααanti4.2三联体不平等交换重排结合而成的一种α-珠蛋白基因簇，同时含有-α3.7和anti4.2片段。虽然HKαα同时含有-α3.7和anti4.2片段，但αα/HKαα血液学表型无明显异常。因HKαα及-α3.7型缺失携带者均存在-α3.7片段，故通过常规Gap-PCR法检测，HKαα携带者会被误诊为-α3.7型缺失携带者。

对α珠蛋白基因αααanti4.2三联体及HKαα进行检测，对于提早发现地贫异常基因的携带者，指导婚前及产前诊断具有重要的意义。

目前检测αααanti4.2三联体和HKαα的技术主要有以下几种。

1、琼脂糖凝胶电泳法：设计引物扩增anti4.2片段，通过琼脂糖凝胶电泳，判断是否存在anti4.2片段。因αααanti4.2和HKαα均包含anti4.2片段，因此这个技术不能鉴别αααanti4.2和HKαα。

2、巢式PCR：根据目标区域设计两对引物，外引物及内引物。使用外引物扩增获得PCR产物后，以PCR产物作为模板，再使用内引物进行PCR。将外引物及内引物的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带有无及大小判断结果。一般使用此方法确认是否存在αααanti4.2或HKαα单倍型，但是仅此方法不能确定受检者的基因型，需要结合其他方法如Gap-PCR或MLPA进行检测，如此一来，操作繁琐。

3、三代测序技术：通过设计引物扩增目标片段后进行建库，获得测序文库后进行三代测序。因为三代测序的长读长优势，可以直接测序鉴别αααanti4.2和HKαα基因型，但是该技术方法需要使用第三代测序仪，仪器昂贵，成本高，因此目前无法大范围推广。

现有技术分别存在不能明确基因型、操作繁琐、成本高的缺点。因此需要一种新的技术方法弥补现有技术缺点。

发明内容