[发明专利]鉴别地中海贫血αααanti4.2杂合型和HKαα杂合型的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种精准鉴别αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型扩增子文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

S1：第一轮PCR

所述第一轮PCR过程中，使用第一引物、第二引物、和第三引物对目标序列进行PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；

其中，所述第一引物从5’端到3’端依次包括第一测序标签序列和目标序列特异性的正向引物序列；所述第二引物从5’端到3’端依次包括第二测序标签序列和目标序列特异性的反向引物序列；所述第三引物从5’端到3’端依次包括第一测序接头序列、样本标签序列、和第二测序标签序列；

S2：第二轮PCR

所述第二轮PCR过程中，使用第四引物和第五引物对所述第一轮PCR扩增产物进行PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物，经纯化后即得所述扩增子文库；

其中，所述第四引物从5’端到3’端依次包括第二测序接头序列和第一测序标签序列；所述第五引物为第一测序接头序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，对多个样本来源的目标序列进行PCR扩增，并且针对不同样本来源的所述第三引物的样本标签序列各不相同，从而实现根据不同的样本标签序列区别不同样本。

3.一种判断αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)构建X1/X2融合而成的anti4.2片段以及HBA2和HBA1基因扩增子文库，

设计引物对，所述引物对包括特异性扩增X1/X2融合而成的anti4.2片段引物对；和扩增片段包含HBA2基因Chr16:223447位置和HBA1基因Chr6:16:227251-227258位置的引物对；

使用所述引物对对样本核酸进行PCR扩增，获得X1/X2融合而成的anti4.2片段和HBA2、HBA1基因扩增子文库；

(2)测序并根据测序HBA2和HBA1的reads比例以及是否含有anti4.2片段判断所述地中海贫血是αα/αααanti4.2还是αα/HKαα基因型。

4.一种能精准鉴别αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括SEQ ID No.1-4所示的引物。

5.根据权利要求4所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物还包括两种测序标签和两种测序接头以及样本标签。

6.根据权利要求4或5所述的引物组合物，其特征在于，所述测序标签为第一和第二测序标签，分别连接于正向引物和反向引物的5’端，所述测序接头为第一和第二测序接头，且第一或第二测序接头连接样本标签和第一或第二测序标签，组成用于鉴别不同样本的引物，所述样本标签为能够鉴别不同样本的特异性核酸序列。

7.权利要求4-6任一项所述引物组合物在制备地中海贫血αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型诊断试剂盒中的应用。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4-6任一项所述的引物组合物。

9.一种利用权利要求4-8任一项所述引物组合物和/或所述试剂盒构建鉴别地中海贫血αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型扩增子文库的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：第一轮PCR

所述第一轮PCR过程中，使用同权利要求4-8任一项所述引物组合物配制多重PCR反应体系，对目标序列进行PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；

S2：第二轮PCR

所述第二轮PCR过程中，使用第四引物和第五引物对所述第一轮PCR扩增产物进行PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物，经纯化后即得所述扩增子文库，所述第四引物为第二测序接头和第一测序标签连接组成的引物，所述第五引物为第一测序接头。

10.一种鉴别地中海贫血αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型的测序平台的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

1)针对X1/X2融合而成的anti4.2片段以及HBA2和HBA1设计如权利要求4-8任一项所述的引物；

设计引物对F1-R1和引物对F2-R2；所述引物对F1-R1用于特异性扩增anti4.2片段上下游基因区段，所述引物对F1-R1中的正向引物F1和anti4.2片段上游基因区段匹配，所述引物对F1-R1中的反向引物R1和anti4.2片段下游基因区段匹配；

所述引物对F2-R2用于特异性扩增HBA2和HBA1基因差异碱基上下游基因区段，所述引物对F2-R2中的正向引物F2和差异碱基上游基因区段匹配，所述引物对F2-R2中的反向引物R2和差异碱基下游基因区段匹配；

2)样本DNA提取

将来自待测病患的血液、唾液或组织等用核酸自动提取仪提取DNA，Qubit Flurometer3.0定量，检测一个样本需要DNA模板约10～30ng；

3)多重PCR扩增获得X1/X2融合而成的anti4.2片段以及HBA2和HBA1的扩增子文库；

4)文库定量，并且使用测序平台测序，对所得序列结果利用软件分析，所述分析原理如下：

经PCR反应，根据正向引物F1和反向引物R1是否扩增出anti4.2片段，以及根据引物F2-R2扩增出HBA2和HBA1的Reads比例，判断具体基因型；

未扩增出anti4.2片段，且HBA2和HBA1的Reads比例为2:2，判断基因型为αα/αα；

扩增出anti4.2片段，且HBA2和HBA1的Reads比例为2:2，判断基因型为αα/HKαα；

扩增出anti4.2片段，且HBA2和HBA1的Reads比例为3:2，判断基因型为αα/αααanti4.2。