[发明专利]一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法

权利要求书

1.一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法，其特征在于，所述规模化制备方法包括如下步骤：

细胞制备：制备鸡胚成纤维细胞悬液；

病毒接种：将保藏编号为CCTCC No:V201950的腮腺炎病毒按照0.001~0.01MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒的细胞悬液以150~250mL/层的添加量加入到细胞工厂中，于33~35℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有150~250mL病毒生长液；

细胞换液：第一次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂，每层加液100~200mL，晃动清洗细胞表面后将液体导出；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第二次培养；

第一次收获步骤：第二次培养66~80h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第三次培养；

第二次收获步骤：第三次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第四次培养；

第三次收获步骤：第四次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液；

或者，所述规模化制备方法包括如下步骤：

细胞制备：制备鸡胚成纤维细胞悬液；

病毒接种：将保藏编号为CCTCC No:V201950的腮腺炎病毒按照0.001~0.01MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒的细胞悬液以150~250mL/层的添加量加入到细胞工厂中，于33~35℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有150~250mL病毒生长液；

细胞换液：第一次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂，每层加液100~200mL，晃动清洗细胞表面后将液体导出；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第二次培养；

第一次收获步骤：第二次培养66~80h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第三次培养；

第二次收获步骤：第三次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第四次培养；

第三次收获步骤：所述第三次收获步骤为：第四次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第五次培养；

第四次收获步骤：第五次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获和第三次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚剪碎，加入胰酶进行消化后吹打，得到鸡胚成纤维细胞悬液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，使用剪刀剪成1~3mm³的组织块后，以4~6mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶，于36~38℃下消化15~25min，消化后进行吹打，制备成浓度为1.7~2.5×10⁶个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。

5.一种腮腺炎减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一：使用权利要求1~4任一项所述的规模化制备方法对腮腺炎病毒减毒株进行规模化制备，得到病毒收获液；

步骤二；对病毒收获液进行分离纯化，得到腮腺炎减毒活疫苗。

6.权利要求1~4任一项所述的规模化制备方法在制备腮腺炎病毒疫苗中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述腮腺炎病毒疫苗为腮腺炎减毒活疫苗。