[发明专利]维生素D及其代谢产物的检测方法

权利要求书

1.一种维生素D及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

配制标准溶液：分别取25-OHD₂标准品、25-OHD₃标准品、24,25-(OH)₂D₂标准品和24,25-(OH)₂D₃标准品，用牛血清白蛋白溶液配制成预定浓度的溶液，得到标准溶液；

配制内标液：取25-OHD₂内标物、25-OHD₃内标物、24,25-(OH)₂D₃内标物和雌三醇，以溶剂溶解，得到内标液；

处理待测样品：取各标准溶液，加入内标液并进行蛋白质沉淀，加入萃取剂进行萃取，取上清液，去除溶剂后复溶，得到待测标准样品；取待测血清样本，加入内标液进行蛋白质沉淀，加入萃取剂进行萃取，取上清液，去除溶剂后复溶，得到待测血清样品；

检测：将标准样品注入液相色谱串联质谱仪中进行检测，构建标准曲线；将待测血清样品注入液相色谱串联质谱仪进行检测，将检测图谱与标准曲线进行比较，得到检测结果；其中，液相色谱采用变流速梯度洗脱，流动相A为体积浓度为0.08％～0.12％的甲酸甲醇溶液，流动相B为体积浓度为0.08％～0.12％的甲酸水溶液。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，变流速梯度洗脱时间程序如表1。

表1.变流速梯度洗脱时间程序

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液中包括磷酸氢二钠、雌三醇、牛血清白蛋白，磷酸氢二钠的浓度为8～9g/L，雌三醇的浓度为0.8～1.2mg/L，所述牛血清白蛋白的浓度为38～42g/L。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述25-OHD₂内标物为d3-25-OHD₂，所述25-OHD₃内标物为d6-25-OHD₃，所述24,25-(OH)₂D₂、24,25-(OH)₂D₃内标物为D6-24,25-(OH)₂D₃；所述内标液中，25-OHD₂内标物的浓度为115～125nmol/L，25-OHD₃内标物的浓度为115～125nmol/L，24,25-(OH)₂D₃内标物的浓度为30～40nmol/L，雌三醇的浓度为0.8～1.2μg/L。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述处理待测样品步骤中，萃取剂为正己烷，复溶所用的溶剂为体积浓度25～32％甲醇水溶液。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述配制内标液步骤中，复溶后离心，保留上清液备用。

7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，液相色谱中所用的色谱柱型号为Ascentis Express C18(5.0cm×2.1mm，2.7μm)。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，柱温为48～52℃，进样量为38～42μL。

9.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，质谱条件如表2。

表2.质谱条件

10.根据权利要求1或9所述的检测方法，其特征在于，质谱源参数：离子喷射电压5400～5600V，雾化气33～37psi，辅助气48～52psi，离子源温度440～460℃，气帘气48～52psi，碰撞气8～10psi。